高三一轮复习生物基因工程课件

本节看点1.真原核生物基因结构的差异2.DNA聚合酶与DNA连接酶的区别与联系3.理解同尾酶定义及应用01.原理与工具02.基因工程的过程原核生物的基因

基因非基因基因通常是具有遗传效应的DNA片段翻译转录mRNA基因2基因3基因4基因1非编码区编码区放大基因3原核生物DNA收裁剪&拼接

翻译收mRNA真核生物DNA基因1基因2基因3基因4

基因

非基因收收

转录hnRNA放大编码区非编码区基因3内含子1外显子1内含子2外显子2内含子3外显子3内含子4内含子外显子基因3编码区放大真核生物的核基因非编码区的结构启动子：

编码区上游能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域终止子：

位于编码区下游，转录过程中能够终止

RNA聚合酶转录的DNA序列，使RNA合成终止调控序列：对基因表达起调控作用的序列的统称编码区非编码区调节基因操纵基因终止子启动子DNA基本结构3'末端TTCGAA5'末端AAGCTT4

153

25'末端3'末端5'末端3'末端G

C

A

T

A

T

限制性核酸内切酶——黏性末端5'

…

A3'

A5'3'

…

TT

C

G

A

5'黏性末端A

A

G

C

TTTTC

G

A

A3'A

G

C

TTA…

3'…

5'…

3'…

5'5'

…3'

…Hind

III5'末端A

A

G

C

T

T

3'末端TTCGAA3'末端5'末端限制性核酸内切酶——平末端5'末端G

A

T

A

T

C

3'末端CTATAG5'

…3'

…G

A

T

A

T

CC

T

A

T

A

GEcoR

V…

3'…

5'3'5'平末端5'3'…

3'…

5'A

T

CT

A

GG

A

TC

T

A5'

…3'

…3'末端5'末端限制性核酸内切酶限制（性核酸内切）酶作用实质断开(水解)磷酸二酯键作用于双链作用结果形成黏性末端或平末端获取目的基因特点识别特定序列（回文序列）来源原核生物（主要）举例EcoR

I

、Alu

lSam

I

、BamH

I

等DNA连接酶5'

…

G

A

T

A

T

C

…

3'3'

…

C

T

A

T

A

G

…

5'

T4

DNA连接酶5'

…

A

A

G

C

T

T

…

3'3'

…

T

T

C

G

A

A

…

5'T4

DNA连接酶

DNA连接酶……3'5'平末端5'3'…

3'…

5'3'A

G

C

TT3'

A…

A…

TT

C

G

AA

T

CT

A

GG

A

TC

T

AA5'5'黏性末端…

3'…

5'ADNA连接酶DNA连接酶作用实质形成磷酸二酯键作用于双链作用结果连接已有DNA片段形成重组DNA举例T4

DNA连接酶（黏性末端&平末端）E.coliDNA连接酶（黏性末端）注意：DNA聚合酶与DNA连接酶并非同一种酶

DNA聚合酶功能为连接游离的脱氧核糖

核苷酸(即形成单链)，形成磷酸二酯键同尾酶识别切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性核酸内切酶称为同尾酶……GC

C

T

A

G……AT

C

T

A

GG

A

T

C

CG……G

A

T

C

TA……BamH

I……A

G

A

T

C

TT

C

T

A

G

AG

G

A

TC

CC

C

T

A

G

G……G

A

T

CC

T

A

………………G

A

T

C

…T

A

A

………

C

T

ASau3A

IBgl

II……同尾酶与二次酶切识别切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性核酸内切酶称为同尾酶同尾酶切出的序列，由于黏性末端一致，可以连接到一起但重新连接的DNA分子能否被相同的限制酶二次酶切，需要依识别序列讨论BamH

I……G

A

T

C

CG…………G

G

A

TC

CC

C

T

A

G

G……GC

C

T

A

GBgl

II……G

A

T

C

TA………………A

G

A

T

C

TT

C

T

A

G

AAT

C

T

A

GCG连接……GCGCATTATA……4.

在受体细胞中

自主复制

或

随受体细胞复制多以质粒形式存在多为重组至宿主细胞染色体上基因工程的载体工具常见载体：质粒（小型环状DNA分子）、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒注意：质粒并非只存在于原核细胞中，许多真核细胞(如酵母菌等)中也存在质粒1.

适宜的多种限制酶切点(好切)2.

具有标记基因

供重组DNA筛选

常为抗性基因3.

具有启动子、终止子

等调控区

以受体细胞中可表达为准良好载体的基本要求复制原点

5.

对受体细胞无害质粒本节看点1.基因组文库与cDNA文库的区别2.单酶切的弊端与双酶切的优势3.表达载体导入受体细胞的不同方式4.目的基因检测的方式及应用01.原理与工具02.基因工程的过程基因工程的步骤复制原点启动子、终止子目的基因

标记基因目的基因的获取表达载体的构建DNA分子杂交分子杂交抗原-抗体杂交性状检测表达载体导入受体细胞目的基因的检测与鉴定动物：显微注射法微生物：Ca2+处理，感受态细胞基因文库法人工合成法基因组文库cDNA文库反转录法

化学合成法植物农杆菌转化法

基因枪法花粉管通道法PCR技术（获取/扩增）基因组文库基因组DNA用限制性核酸内切酶酶切基因组文库内含完整编码区(外显子

+

内含子)所以基因组文库不适宜直接导入原核生物细胞内表达导入噬菌体进行克隆导入细菌进行克隆随机大量酶切为多个片段随机大量酶切为多个片段cDNA文库操作文库大小基因多寡启动子终止子内含子物种间交流基因文库酶切⼤多有有大都不可以cDNA文库逆转录⼩少⽆⽆大都可以与基因组文库的制作方式不同，

cDNA文库提取mRNA作为模板，通过逆转录形成cDNA并保存注意：cDNA文库DNA分子没有启动子、终止子及内含子序列，更加适合种间基因交流分别导入

受体细胞提取mRNA逆转录+质粒增殖mRNAcDNA人工合成人工合成反转

录

法目的基因的

mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA双链DNA(目的基因)反转录法的具体操作已知蛋白质的氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测目的基因的核苷酸序列DNA合成仪

化学合成目的基因化学合成法的过程化学合成法表达载体的构建表达载体终止子复制原点

标记基因目的基因启动子质粒

同一种限制酶

DNA连接酶单酶切及其弊端质粒自身环化×目的基因反接×若只用同一种限制酶处理DNA连接酶处理目的基因正接双酶切及其优势DNA连接酶处理目的基因正确连接若用两种不同的限制酶同时处理目的基因及质粒

分别创造不同的两侧末端双酶切：

防止目的基因的反向连接及质粒自身环化现象产生目的基因(表达载体)导入受体细胞(植物)注意：双子叶和裸子植物受到伤害会产生酚类化合物，吸引农杆菌农杆菌转化法是受体细胞为植物细胞时最普适的转入方法即使受体细胞为单子叶植物细胞，也可以通过添加酚类物质完成转入及表达受体细胞为双子叶植物：

农杆菌转化法受体细胞为单子叶植物：基因枪法

此外还有花粉管通道法等方法表现出新性状

的植株含重组Ti质粒

的农杆菌插入染色体的目的基因DNA植物细胞表达载体再生植株培养为农杆菌Ti质粒T-DNA构建转入导入目的基因(表达载体)导入受体细胞(动物or微生物)显微注射法注意：若想最终获得转基因动物，则表达载体必须直接导入受精卵中43℃;

2minCaCl2处理质粒与钙离子结合

吸附在细胞外受体细胞为微生物细胞受体细胞为动物细胞CaCl2转化法质粒进入细胞感受态细胞感受态细胞正常细胞目的基因的检测与鉴定进没进去是否转录是否翻译性状体现待测物DNAmRNA蛋白质个体性状检测逻辑目的基因是否存在DNA分子杂交DNA-DNA分子杂交是否出现杂交带目的基因是否转录分子杂交DNA-DNA分子杂交是否出现杂交带目的基因是否翻译抗原-抗体杂交是否出现杂交带个体是否表现性状抗虫、抗病抗抗生素等接种实验是否存活习题精练苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A

、B

、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组

载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，

Tc为四环素抗性基因，

lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产

物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割

位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：(1)将正常的D基因导入受体细胞的基因工程操作步骤中，其核心是

,据图分析上述甲图中三种质粒中不宜作为运载体的有

，请分析原因

习题精练苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A

、B

、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组

载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，

Tc为四环素抗性基因，

lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产

物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割

位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：(2)若要获取目的基因D，上述乙图中应选择限制酶

对其所在的DNA进行切割，如果仅知道D基因首位的部分核苷酸序列，通常可根据该基因首位两端的已知核苷酸序列合成

,利用

技术得到大量的目的基因习题精练苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A

、B

、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组

载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，

Tc为四环素抗性基因，

lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产

物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割

位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：(3)将目的基因D和甲图中可做载体的质粒进行连接后，会得到图丙中三种连接方式。需要选出正向连接的重组质粒，可使用

酶切割所获得的重组质粒。完全酶切后进行电泳分析。若是载体自连，电泳图谱

中出现2.7kb一条带，若是正向连接载体和反向连接载体，电泳图谱中出现长度分别为

和

.习题精练苯丙酮尿症是PKU基因突变引起的，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入到有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A

、B

、C三种质粒，图乙为含有目的基因D的DNA片段，图丙表示重组

载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，

Tc为四环素抗性基因，

lacZ为蓝色显色基因(基因表达的产

物将无色化合物X-gal转化为一种蓝色物质，菌落呈蓝色)，

EcoRI(0.7kb)

、PvuI(0.8kb)等为限制酶及其切割

位点与复制原点之间的距离。已知1kb=1000碱基对，请结合所学知识回答：(4)选择自身不含lacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，在已转化的含重组质粒、空质粒的受体细胞中和未转化成功的细胞中如何筛选出成功导入重组质粒的受体细胞性状检测——双标记问题在真实的基因工程相关实验中，若表达载体上只有一个标记基因(如抗性基因)，则通过含抗生素培养基筛选后所得菌落有两种可能，其一为含有完整表达载体，其二为只含有空质粒，内部并没有目的基因存在。因此在实际操作中常使用双抗性标记，以平板影印法辅助鉴定完成基因工程操作进行目的基因检测含四环素培养基四环素抗性基因目的基因启动子Tetr复制原点

表达载体终止子性状检测——双标记问题在真实的基因工程相关实验中，若表达载体上只有一个标记基因(如抗性基因)，则通过含抗生素培养基筛选后所得菌落有两种可能，其一为含有完整表达载体，其二为只含有空质粒，内部并没有目的基因存在。因此在实际操作中常使用双抗性标记，以平板影印法辅助鉴定Pst

I酶切位点1472583691458369Tetr四环素抗性基因Ampr青霉素抗性基因完成基因工程操作进行目的基因检测含四环素培养基含青霉素培养基沾取菌落无菌绒布习题精练(1)获取目的基因的方法很多，上图是利用人生长激素mRNA

。而在构建基因表达载体时必须使用的酶是

和

。⑤过程要用CaCl2处理大肠杆菌，目的是

。(2)如果限制性内切晦Pst

l

、EcoR

l和Hind

lll对质粒pBR322进行切割，用两种晦、三种晦分别切割时，则形

成的DNA片段共

种，其中含有完整四环素抗性基因的DNA片段的所占比例是

。习题精练(3)如果只用限制性内切酶Pst

I切割目的基因和质粒pBR322，完成过程

④、⑤后，将三角瓶内的大肠杆菌（不含Ampr

、Tetr抗性质粒）先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。能在乙培养基上生长的大肠杆菌是含有

抗性基因，含有目的基因的大肠杆菌应该在

（填“乙培养基”、“丙培养基”）性状检测——“蓝白斑”(报告基因)问题已知：lacZt编码Z酶氨基端的一个片段(称为α-肽)α-肽、缺失α-肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时

就会表现出Z酶活性底物X-gal正常大肠杆菌

表达Z酶水解为蓝色物质所谓“报告基因”是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且实验材料原本不会产生的性状的基因Sal

I酶切位点lacZt

基因报告基因青霉素抗性基因性状检测——“蓝白斑”(报告基因)问题所谓“报告基因”是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表