高中生物选修1生物技术实践 知识点汇总

本中士物送修一金物我木实栽和软鱼总辂

4题一铐饯发铸技水的应用课题一半港《。果拂的制行

1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。

2、有氧发酵：醋酸发酵无氧发酵：酒精发酵乳酸发酵

3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌酵母菌的生殖方式：出芽生殖（主要）分裂生殖抱子生殖

酸

4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸,大量繁殖。C6Hl2O6+6O2-6CO2+6H2O

酶

5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。C6H1206-2C2HS0H+2C02

6、20℃左右展适宜酵母菌繁殖酒精发酵时一般将温度控制在18C-25c

7、在葡萄酒自然发酵的过程中，起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型典菌。在发酵过程中，

随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈现深红色。在缺氧呈酸性的发酵

液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

8、醋酸菌是单细胞细菌（原核生物），代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂

9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸;当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为

乙醛，再将乙醛变为醋酸。C2H50H+O2^CH3C0OH+6H20

10、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中

断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30〜35C,控制好发酵温度，使

发酵时间缩短，乂减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧

化。

11、实验流程：挑选葡萄f冲洗f榨汁f酒精发酵f果酒（一醋酸发酵f果醋）

12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重格酸钾来检验。在酸性条件下,重铭酸钾与

酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2mL,再滴入物质的量浓度为3mol/L的H2S0,3滴,

振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铝酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色

13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用

来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与

瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧

化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气

泵，输入氧气。

嶷难解率

(1)你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？

应该先冲洗，然后再除去枝梗,以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。

(2)你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？

如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气

时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。

(3)制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18〜25℃?制葡萄醋时，为什么要将温度控制在

30〜35℃?

温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20C左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最

适温度范围内。而醋酸菌是适温菌，最适生长温度为30〜35℃,因此要将温度控制在30〜35℃。

(4)果酒发酵变为果醋发酵需要改变的条件有哪些？

通入氧气、提高温度。

总给累涌制作多累错制作的对比「

果酒制作果醋制作

酵母菌醋酸菌

菌种

附着在葡萄皮上野生酵母购买，食醋中分离

发来源

菌，或者分离获得纯净酵母

酵曲AT电奔

单细胞，真核生物，单细胞，原核生物

分类地位

出芽生殖、抱子生殖二分裂生殖

菌繁殖方式

30〜35℃

发温度18C-25C

10-12天7-8天

时间

酵

前期有氧，后期无氧有氧

氧气

条发酵液的酸性条件发酵液的酸性条件

pH

有氧条件下，大量繁殖：糖源充足：

醐

醐

C6Hl2。6+202f2c。2+2CBC00H

C6Hl2。6+602+6H2。f6C02+

+2H0

反12H2O2

缺少糖源：

应无氧条件下，酒精发酵：酶

嗅味、幅尝、镜检酵母菌、嗅味、品尝、镜检醋酸菌、观

结果检测

重铝酸钾检测酒精察菌膜、检测前后pH变化

联系醋酸发酵可以在酒精发酵的基础上进行

镭鹿二腐丸的制6

1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉

是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是苑子生殖。营腐生生活。

2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将

脂肪水解为甘油和脂肪酸。

3、实验流程：让豆腐上长出毛霉一加盐腌制一加卤汤装瓶一密封腌制

4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。

前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛霉形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳

的香气。（后期发酵，毛霉被杀死不等于所有微生物被杀死）

5、将豆腐切成3cmX3cmXlcm的若干块。所用豆腐的含水量为70%左右，水分过多则腐乳不易成

形。

•毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在15〜18C,并保持一定的温度。

来源：1.来自空气中的毛霉抱子2.直接接种优良毛霉菌种时间：5天

•加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加

盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。

.用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败

变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味

•食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质2.析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中

不易酥烂3.调味作用，给腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。

•配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒

的含量一般控制在12%左右。

•酒的作用：1.防止杂菌污染以防腐2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味3.酒精含量的高低与腐

乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延

长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。

•香辛料的作用：L调味作用2.杀菌防腐作用3.参与并促进发酵过程

•防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小

心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火

焰，防止瓶口被污染。

疑睢解答

（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？

豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。

（2）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？

含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。

（3）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它

对人体有害吗？它的作用是什么？

“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，

使腐乳成形。

镭题三和。泡菜

•制作泡菜所用微生物是乳酸菌,其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，降糖分解为乳酸。分

酶、

裂方式是二分裂。反应式为：C6H12062c3H6。3+能量

常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。

•亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。

•膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康,国家规定肉制品中不超过30mg/kg,酱腌菜中不超过

20mg/kg,婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜pH、温度和一

定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。

•一般在腌制10天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好

专题二能住物的傅春⑨应用

礴趣一微住物的安老金脩养

一、修舞壅

•培养基按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固

剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微

生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液

体培养基应用于工业或生活生产，主要用于大规模培养。固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，

半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。

•按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制

而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然

物质配制而成，常用于实际工业生产。

•按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入

某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生

物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

•培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。

.碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO”NaHCOs等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼

等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

.氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如此、N【h、N0:、NII；（无机氮源）蛋白质、氨基酸、

尿素、牛肉膏、蛋白陈（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用用。

•培养基还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在

培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微

碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件。注意：牛肉膏蛋白陈既是氮源又是碳源。

二、无菌技术

1、获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免己经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

•无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

2、消毒与灭菌的区别

消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不

包括芽抱和抱子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学

药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽抱和抱子。灭菌方法有灼

烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

•灭菌方法：

①接种环、接种针、试管门等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

注意：一般培养基用高压蒸汽灭菌，培养皿是干热灭菌。

三、制作牛肉膏蛋白陈固体培养基

1、方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（如果调pH,在灭菌之前）

2、倒平板操作的步骤：

①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。

③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10〜

20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

④等待平板冷却凝固，大约需5〜lOmin。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在

上。

3、•倒平板操作的讨论

(1)培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基

的温度？

提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进

行倒平板了。

(2)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

(3)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既

可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

(4)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来

培养微生物吗？为什么？

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微

生物。

四、纯化大肠杆菌

1、微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

2、平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到

培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这

就是菌落。

稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀建，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培

养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

3、用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能

在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

4、平板划线法操作步骤：注意：只需蘸取一次菌液。

①将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环,并打开棉塞。

③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速

伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，

从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不

要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

•平板划线操作的讨论

(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍

然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前

灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种

直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便

得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操

作者。

(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

(3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细

菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

5、涂布平板操作的步骤：

①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。

③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8〜10s。④用涂布器将菌液均匀地

涂布在培养基表面。

•涂布平板操作的讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，

第2步应如何进行无菌操作？

提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要

接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。

6、菌种的保存

(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入££

的冰箱中保藏。以后每3〜6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混

匀后，放在一20C的冷冻箱中保存。

疑睢翩答

(1)生物的营养

人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。

植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。

微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

(2)确定培养基制作是否合格的方法

将未接种的相同培养基在相同环境中培养1〜2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，

否则需要重新制备。

课题二土壤中分解屎素的偈筠的分离与针政

尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解

成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成服酶

尿素最初是从人的尿液中发现的

1.筛选菌株

(1)实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物

生长.

(2)选择性培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,

称作选择培养基。

(3)配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入

有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高

浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

2.统计菌落数目

(1)测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数(血球计数板)：

(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通

过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，每一个稀释

度下一般设置3〜5个平板,选择菌落数在30〜300的平板进行计数,并取平均值。统计的菌落数往

往比活菌的实际数目低,因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2.统计的是活菌数量3.

统计数量比实际数量可能偏小。(考虑到菌落混杂的情况)

3.实验操作

(1)土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土

壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH七7的土壤中取样。铲去表层土，在距地

表约3〜8cm的土壤层取样。

(2)样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一

定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间，适于计数的平板。

测定土壤中细菌的数量，一般选用IO"IO，1()6

测定放线菌的数量，一般选用10310，1()5

测定真菌的数量，一般选用IO?1(/1。

(3)微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃:T2天

放线菌25~28℃5~7天霉菌25~28℃3~4天

(5)菌落计数

每隔24小时统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时

间不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、唯独及培养时间)，

同种微生物表现出稳定的菌落特征(形状、大小、隆起程度、颜色)

（6）分解尿素的细菌鉴定

细菌合成的胭酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强，在以尿素为唯一氮源的培养基中添加

酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂变红，初步鉴定该细菌能够分解尿素。

4.疑难解答

（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值

每克样品中的菌落数=（C/V）*M其中，C代。某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代衣

涂布平板时所用的稀释液的体积（ml）,M代表稀释倍数

例题：分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（①③⑤⑧）

①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐

诿麴三分解纤摊素的微生物的分离

1.纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的大分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

2.纤维素与纤维素酶

（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材.、作物秸秆等也富含纤维素。

（2）纤维素醒是一种复合酶,-一般认为它至少包括三种组分，即3酶、Cx酶和葡萄糖昔酶，前两种

酶使纤维素分解成纤维：糖，葡萄糖昔酶将纤维：糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，

为微生物的生长提供营养。

3.纤维素分解菌的筛选

（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不和水解后的纤

维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基

中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红一纤维素的复合物就无法形成，

培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤

维素分解菌。注意：能产生透明圈不一定就是纤维素分解菌，需要进一步进行鉴定。

4.分离分解纤维素的微生物的实验流程

土壤取样f选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)一梯度稀释一将

样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上一挑选产生透明圈的菌落

(1)土壤采集选择富含纤维素的环境。

(2)选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)：

①目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离所需的微生物

②方法：利用富含纤维素的选择培养基。将土样加入到含有选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定

在摇床上，在一定温度下震荡培养l-2d,直到培养液变浑浊。可重复选择培养。扩大培养用液体培

养基。(液体培养基)

(3)稀释涂布：吸取适量的培养液，稀释涂布到鉴别培养基上(纤维素作为唯一碳源，刚果红加入

方法有两种)，倒置培养。

(4)挑选菌落：挑选产生透明圈的菌落。

(5)刚果红染色的两种方法

一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

5.课题延伸

能产生透明圈不一定就是纤维素分解菌。对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分

离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的

发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素

后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

疑难解答

(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因

此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

(2)将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环

境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。

(3)两种刚果红染色法的比较

先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间

发生混杂;其优点是这样显示出的透明圈基本上是纤维素分解菌的作用。

在倒平板时就加入刚果红；优点是操作简便,不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、

土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉

酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的

透明圈相区分。另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚

果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

（4）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适

应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

补充：如何根据需要设置对照？

（1）判断培养基是够有杂菌污染：需要将未接种的相同培养基在相同条件下同时进行培养。

（2）判断培养基是够起到了筛选作用：需要同时设立牛肉膏蛋白陈培养基（全营养培养基、LB培

养基）进行同样接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目是否有显著差异。

专题三错扬的国①.修森技术

诬胭一茹花的££卬修森

一、植物组织培养的基本过程

细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。

离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细

胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细

胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进

行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地

里，可以发育成完整的植物体。

二、植物细胞工程

1.

无菌、适宜温度

细胞分裂素〉

离

体生长素

意-

植

移

组

脱分化伤

再分化

物

栽

纨

组

体

织

或细胞分裂素

细

以生长素细胞分裂素

胞

V生长素

一__________)-------------------------->

-----YX

不需要光需要光

2.具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞,都具有发育成完整个体的能力,即每个生物细胞

都具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下,

通过基因的选择性表达,构成不同组织和器官。

3.植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖;培育脱毒作物;制作人工种子;培育作

物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。

4.细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？

使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。

5.比较根尖分生组织和愈伤组织的异同

组织类型细胞来源细胞形态细胞结构细胞排列细胞去向

根尖分化成多种

受精卵正方形无液泡紧密

分生组织细胞组织

愈伤组织高度分化细胞无定形高度液泡化疏松再分化成新个体

哪电啪身地枷胪如

得鬣a-分裂进行细胞增殖

也河科：小1可附稹物组织，堵乔的雄劾程度表利侬天。但物付科的侬拌且段天祭到试验的成败。植

物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物

的茎上部新萌生的侧枝作材料。-一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长

旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。

7.营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。

常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg,微量元素是Fe、Mn、B、

Zn、Cu、Mo、I、Co,有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。

激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素

存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物

激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。

生长素/细胞分裂素比值与结果

使用顺序实验结果

比值高时促根分化，抑芽形成

先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化

比值低时促芽分化，抑根形成

先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化

比值适中促进愈伤组织生长

同时使用分化频率提高

环境条件：PIk温度、光等环境条件。

不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右,温度控

制在18~22℃,并且每日用日光灯照射12h.

8.操作流程

配制MS固体培养基：配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的退缩液（培养基母液）。

•使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸储水稀释。

.配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液,并

用蒸储水定容到1000毫升。

.在菊花组织培养中，可以不添加植物激素原因是菊花茎段组织培养比较容易。

•灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

•MS培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS培养基有哪些特点？

大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维

生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。

微生物培养基以有机营养为主,MS培养基则需提供大量无机营养。

外植体的消毒外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩

枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。

用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动2~3次，持续6~7s,立即

将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%

的氯化汞溶液中r2min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

注意：对外植体进行表面消毒时;就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。

接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7〜8个外植体。外植体接种与细

菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。

培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（18~22℃）和光照（12h）

移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后

将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。

栽培

外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌

污染；锥形瓶密封性差等。

专胭/DNA彳。曙面底技木

谍胭一DNA的相提叙与鉴定

一、原理

1.提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

2.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶解,需要使用什么浓度？要使DNA析出,

又需要使用什么浓度？、

在0.14mol/L时溶解度最小;较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。I--------

3.在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2moi/LNaCl溶液：将DNA分子析出的方-----------

法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸储水，以稀释NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但

DNA却不能溶于酒精（特别是95%冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降

低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

4.采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？

将DNA和蛋白质进一步分离。

5.提取DNA还可以利用DNA对蛋白酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的

酶和怎样的温度值？

蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为60〜80℃,

因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。

补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变

性温度在95℃。

6.洗涤剂在提取DNA中有何作用？

洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。

7.当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定？

在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。二苯胺现配现用。

8.原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以从细胞中提取和提纯DNA：再利用

酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否

是DNA。

二、实验材料的选取

不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的

原则。

木实脍用鸡血细胞做实找材料仃两个原因。•是因为鸡则织［虺核的］）\\含豆卜:宦，材料场得：

二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高,

操作繁琐，历时较长。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，

最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

三、破碎细胞，获取含DNA的滤液

•若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？

在鸡血细胞液中加入一定量蒸镯水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗

涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。

•为什么加入蒸播水能使鸡血细胞破裂？

答：蒸储水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加

上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。

•在以上实验中，加入蒸偏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。

血细胞在蒸镯水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解D\A物质；选用尼龙布进行过滤。

•在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？

破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少，影响实验结果,

导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

具体做法。10mL鸡血+20mL蒸储水一同方向搅拌一3层尼龙布过滤一滤液

四、去除滤液中的杂质

为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质？

用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除

去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多

种杂质。

最初求得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，

不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

方案二与方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和

蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。、\

\_\

五、析出与鉴定\|、

•在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？/|二一,

滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2〜3分钟，析出的白色丝状物就

是DNA。DNA呈白色。

•怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？（注意对照）

具体做法。试管2支，编号甲乙一各加等量5mLNaCI溶液一甲中放入少量白色丝状物，使之溶

解f各加4mL二苯胺，混合均匀一沸水浴5minf观察颜色变化

六、实验操作

制备鸡血细胞液.......加柠檬酸钠,静置或离心

破碎细胞，释放DNA…加蒸储水,同一方向快速通方向搅拌

I-过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA.......加入NaCl至2mol/L,同一方向缓慢搅拌

I

DNA析出............加蒸析水至0.14mol/L,过滤,在溶解到2moi/L溶液中

If除去细胞质中的大部分物质。

DNA初步纯化.......与等体积95%冷却酒精混合,析出白色丝状物

I-除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鉴定............二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯;

使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢(细胞破裂快速搅拌)；玻棒不要碰到烧

杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

专巡五DNA彳。雷后届技术

谍胭二多莱痛金式反应抄网DNA仰殿

一、PCR概况

即多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR),是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，

它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为

样品中DNA含量太低而难于对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破

案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。

二、体内DNA复制回顾

1、①定义：以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程。

②场所：主要在细胞核中，随着染色体的复制而完成。

③时期：主要是有丝分裂的间期和减数第一次分裂的间期。

④复制条件

细胞内DNA复制条件组分作用

模板DNA的两条单链提供复制的模板

原料四种脱氧核昔酸合成DNA子链的原料

解旋酶打开DNA双螺旋

酶

DNA聚合酶催化合成DNA子链

能量ATP为解螺旋和合成子链供能

引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3'端起点

注意：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3'端延伸DNA链。因此，DNA复

制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3,

端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。

VM方向

(U5-6DNAVM方向的”;念阳

3'

慎头住

(leadingstraind)

S'前导处

3'的从跄后fit链

(laggingstrand)

注意：引物和模板链的3,端碱基互补配对。并不是在两端随意互补配对的。

2、DNA的复制过程:

a.解旋：利用细胞提供的能量，在解旋酶的作用下，DNA分子氢键断裂，两条螺旋的双链解开；

b.合成子链：以解开的每一段母链为模版，在DNA聚合酶的作用下，利用细胞中游离的4种脱氧核

甘酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一段子链；

c.子链延伸：随模版链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸.同时，每段新链与其对应的

模版链盘绕成双螺旋结构；

d.形成2个新的DNA分子：复制结束，1个DNA分子形成2个完全相同的DNA分子，新复制的2个

子代DNA分子，通过细胞分裂分配到2个子细胞中去；

3、体内DNA复制特点

a.半保留复制b.边解旋边复制

c.半不连续

d.多起点复制（仅限真核生物）

e.新链的合成方向：子链5'端-3'端

f.双向复制

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？

RNA合成、蛋白质合成。

三、PCR的原理及条件

1、a.原理：利用DNA双链复制的原理，将目的基因的核甘酸序列不断地加以复制，使其数量呈指

数方式增加。

b.前提：要有一段已知目的基因的核甘酸序列，以便根据这一序列合成引物。

c.需要条件：①DNA模板②两种引物③4种脱氧核甘酸④耐热的DNA聚合酶（Taq酶）⑤缓冲液和

温度控制

2、a.为什么不需要解旋酶？

DNA复制过程中，双链的解开是进行DNA复制的前提。在体外，可以通过控制温度来实现这一过

程.在80—100C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性.当温

度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了D\A的热变性原理，

通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

b.为什么需要耐热的DNA聚合酶？

高温解决了DNA双链的打开问题，但是会导致DNA聚合酶失活。耐高温的TaqDNA聚合酶的发现

和应用，不仅解决了上述问题，且大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋于自动化。

C.为什么需要两种引物？

3'।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।—S'

DNA双畦模板"LLLLLLLLLLLLL1工LLLLLL□二，

|第一步

第一步：DNA变性3'-------------------------------------------------------5'

成为单群5'-------------------------------------------------------3'