培养细胞的检测指标

视频：bio863-跨越世纪的生命赞歌——863计划生物技术领域15周年回眸细胞培养室中下列物品该如何消毒？玻璃培养瓶，移液管，试管等玻璃器皿？超净工作台台面？金属手术器械？不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等？橡胶塞和塑料瓶盖等？细胞培养室？操作人员的手部？实验室桌面、地面等？视频：灭菌和消毒技术.wmvChapter3细胞培养的基本方法◆无菌操作技术◆培养细胞的观察◆常用的染色方法◆细胞培养的污染和检测/◆无菌操作成功或失败的首要条件◆培养前准备操作卡片用品置于场地，然后消毒操作野消毒洗手和着装火焰消毒一、无菌操作技术要领动作准确敏捷不用手触及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定顺序培养用瓶和吸管的放置防止各种用液的交叉污染不向操作野讲话或咳嗽视频：03细胞培养之无菌操作.rmChapter3细胞培养的基本方法◆无菌操作技术◆培养细胞的观察◆常用的染色方法◆细胞培养的污染和检测

由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法等。

细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。二、培养细胞的观察方法1.肉眼观察肉眼观察培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。（指示剂：酚红）培养时，细胞代谢会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。发现培养液变黄，应及时换液传代。一般生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。

苯酚红Phenolred

别名：酚红；苯酚磺酞；Phend-sulphonphthalein

分子式：C19H1405S相对分子质量：354．38性状:红色结晶性粉末。微溶于水，易溶于乙醇及碱溶液，不溶于三氯甲烷及醚。溶于稀碱溶液呈红色。

用途：酸碱指示剂，pH值1.2（橙）～3.0(黄），6.5（棕黄）～8.0(紫红）酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。问题：细胞培养过程中，培养基会逐渐变黄，为什么？培养基如果暴露在空气中会逐渐变紫，为什么？（page45）生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。发现这种情况应及时处理。2.显微镜观察◆倒置显微镜培养的CHO细胞◆相差显微镜视频：相差显微镜的使用.wmv相差显微镜由相差聚光器和相差接物镜两个主要部分组成。它与普通光镜相比多了两个部件，一个是在聚光器上增加一个环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥、聚焦到标本上。另一个是在物镜的后焦面增加一个相板，相板有一个环形区，其大小恰好通过环形光阑束的直射光，相板各区镀以不同物质，使得通过环形区的光比通过相板其他部位的光超前或滞后1/4λ相差显微镜的结构

相差显微镜的基本原理把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰可见。光线透过标本后，发生折射，偏离了未通过标本的光线的光路，这两组光线合轴后，则发生相互干涉现象。透过生物标本发生折射的光线与未透过标本的光线之间产生了光程差。前者被阻滞了1/4λ(波长)。如果把光程差再增加1/4λ，则变为1/2λ，合轴后两束光线的干涉加强，使标本周围发生晕圈，提高了可见度。相差显微镜观察活细胞的步骤首先调好相位板，使聚光器相位板号与接物镜放大倍数(相位板)相一致。然后抽出接目镜，再换辅助望远镜，移动辅助镜筒并调整聚光器相位板，使视影中两个大小一样的光环相互吻合。再重新换上原接目镜，即成相差图像。当更换不同倍数接物镜时，需按上述过程重新调节。用相差显微镜观察细胞应注意瓶（或皿）的厚度、均匀性、清洁度、气温等。经标准化生产的培养板、培养瓶（或皿）一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。天气较冷时，若与显微镜观察处温差较大，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，此时可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。若对原代细胞培养进行相差显微照相，最好选择换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈振荡。观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。思考

某种药物（或向细胞中转入某个新基因；或抑制细胞中某个原有基因的表达后）对培养的某种肿瘤细胞的形态和生长增殖的影响。提示：（1）细胞形态的观察手段和观察指标（2）检测细胞生长增殖状态的手段和指标视频：抗肿瘤药物临床前药效学评价关键技术及平台研究顺利通过验收.asf三、培养细胞的检测指标1.细胞计数细胞生长状况有关指标的检测方法

Cellcountingusingahaemocytometer

细胞数/毫升细胞悬液＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数1毫米计数原则：不数死细胞（染蓝）、压线细胞数上不数下，数左不数右，一团细胞按一个计数！视频：细胞计数.wmv1毫升＝1立方厘米2.细胞生长曲线如何作？page73三、培养细胞的检测指标◆生长曲线是培养细胞生物学特性的基本参数之一，是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标。◆常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响！3.细胞分裂指数细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为：用秋水仙素将细胞处理1～2小时后，按染色体制片法制片并染色，计算1000个细胞中分裂相的数目，重复4次取平均值，用百分比表示。

三、培养细胞的检测指标基本步骤：(1)细胞准备用盖片(支持物)培养法。(2)每24小时取出一个小玻片，按常规方法进行固定，吉姆萨或HE染色，封片，制成永久标本。(3)显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞多、中、少3个区域各一区，共数1000个细胞，计算出平均分裂相值所占百分比。观察时要掌握好分裂相标准，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以减少误差。

细胞分裂指数=细胞分裂相数/细胞总数(1000)×1000

4.细胞贴壁率

细胞贴壁率又称细胞接种存活率。它是细胞被制成分散的悬液后，以低密度(2～5个细胞/cm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值，用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力。三、培养细胞的检测指标（1）取对生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞的原则，将细胞接种于培养瓶(浓度相对高些)。接种12～15瓶。（2）每2小时取出一瓶细胞，倒掉培养液，然后加入胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面公式逐个计算每个时间上的贴壁率。每2小时一次，共观察24小时即12。接种存活率%(贴壁率)=(贴壁存活细胞数/接种细胞数)×100%基本步骤：5.克隆形成率细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。三、培养细胞的检测指标平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃5%CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

克隆数

克隆形成率=—————×100%

接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5%CO2温箱中培养10～14天。(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。5.细胞周期标记有丝分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TdR。三、培养细胞的检测指标50100TG20TMTsTcTG2+1/2TM常以TC-

（TG2+TM+TS）的方式求出TG16.MTT法测定细胞活力四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，

四唑盐比色法的原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。三、培养细胞的检测指标操作步骤：（1）细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。每隔24小时测量一个点，3个平行样品！视频：药物对细胞增殖的影响——细胞生物学实验教学案例.wmvRNAi基因抑制对细胞生长和增殖的影响.ppt基因抑制对细胞生长和增殖的影响.pptChapter3细胞培养的基本方法◆无菌操作技术◆培养细胞的观察◆常用的染色方法◆细胞培养的污染和检测离体活细胞染色观察中性红染色

中性红是常用的活体染色染料，常用的浓度为1:10000，用生理盐水(或Hanks液)溶解后进行高压蒸气灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。台盼蓝染色

用0.5%浓度的台盼蓝（Trypanblue）,用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。细胞死活鉴定——染料排除检测法溴化乙锭（EB）和碘化丙啶（PI）染色

嵌入核酸双链之间，只能标记死细胞！（红色荧光）AcridineOrange（AO）丫啶橙可染活或死细胞，同时标记DNA和RNADNA：绿色荧光RNA：红色荧光荧光染料染色观察Chapter3细胞培养的基本方法◆无菌操作技术◆培养细胞的观察◆常用的染色方法◆细胞培养的污染和检测一、污染途径◆空气◆器材清洗消毒不彻底◆操作◆血清◆组织二、污染对培养细胞的影响及检测最严峻的挑战-污染(contamination)

细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。

细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：1)培养液的酸碱度发生异常的改变。2)培养液出现混浊。3)光镜观察到菌丝和颗粒。4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。

细菌污染培养液浑浊镜下可见菌体真菌污染大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错支原体污染最常见、不易察觉大小介于0.2-2µm，约1%可通过滤菌器对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效“正常”感觉腺苷酸环化酶精氨酸检测◆支原体检测:

支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰DNA的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。支原体检测方法和处理

1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。2）直接培养法：实验室常用。3）放射自显影检测：4）DNA分子杂交：

检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理支原体污染电镜照片（×30K）病毒的污染及检测1）致细胞病变效应（Cytopathiceffect,C