耐高温、耐酸硷乙醛脱氢酶的护肝解酒原理

利用耐高温乙醇氧化酶清除人体内的酒精葛莘随着生活水平的提高,人们消费酒精类饮料的数量也越来越大。科学研究及统计分析表明，酒精产品对人们的身体健康、家庭生活和社会活动都有诸多负面影响。在美国,平均每年有九千万人次急诊病患与饮酒有关，每年有一千人死于饮酒过量。据2000年10月14日《大连日报》报道，中国的酒精依赖患病率在过去十年中增长了近五倍由0.12%增加到0.68%,其中因酒精中毒死亡者增长了10倍。流行病学研究也证实，在精神病院中,近年来因酒精中毒或酒精中毒障碍住院的病人明显上升。如吉林省延边地区，该比例从1964-1979年平均0%—4%上升至1979-1985年的8.0%—23.5%(沈渔邨，1987,1996)。酒精对人体的危害酒精对人体有害,对肝脏最为严重,胃肠道、胰腺、心脏、肾脏等也会造成不同程度的损害。因此，世界卫生组织(WHO)在一份报告中提出：“酒精中毒是当今世界世界内第一公害，其毒性可累及全身主要脏器，对肝脏的影响最大。在西方国家，80%肝硬变(livercirrhosis)的原因是酒精中毒。酒精中毒对病毒性肝炎、肝癌的发生、发展及预后都有着重要影响。”酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化，最终可演变为肝癌。在欧洲，饮酒量越高的国家，因肝硬化而导致的死亡率越高。比如，瑞典、丹麦、和英国等国家的人均年饮酒量在10升以下，他们的肝硬化死亡率在万分之十以下;而法国的人均年饮酒量高达27升，他们的肝硬化死亡率是上述国家的三倍。近年来随着生活水平的提高，酒精性肝病在我国也达到了不容忽视的程度。据统计，我国11亿中的酒民三亿多人，共中酒精性肝病的发病率在20%左右。由于肝脏的代偿能力极强，疾病早期一般没有症状或某些单一的症状不足以引起注意，因此，就诊时往往到了比较严重的程度，甚至到了肝脏的失代偿期。在肝硬化阶段，如果不积极治疗，继续酗酒的话，患者在2-4年内的存活率极低。酒精的毒害主要来自乙醛科学家早就证明，乙醛的毒性是乙醇的十倍，所以乙醛是导致酒后症状的主要化学物质(BrienandLoomis,1983)。乙醛对大脑内胺代谢、ATP酶，细胞线粒体的呼吸功能、脂肪酸氧化功能，以及心肌蛋白质的合成都有很强的抑制作用。乙醛化学性质活泼，与儿茶酚胺结合能够形成吗啡类似物，是造成酒瘾的主要化学物质；乙醛使羟色胺代谢发生故障，产生有幻觉作用的四氢-—咔啉，造成酒后的种种精神障碍(CunninghamandBailey, 2001；Eriksson， 2001)。医学界也早就知道过分喝酒可能导致与上消化道有关的癌症。但是，科学试验证明，酒精本身并不致癌。那么，饮酒与上消化道癌的关系是怎么建立起来的呢？越来越多的研究表明，酒精的第一个代谢产物，乙醛，可能是致癌的凶手(Homannetal．,2000)。一项国际研究工作发现，族群中基因的一个主要区别可能导致唾液具有更高的致癌可能性(Vakevainenetal.,2000)。这篇研究报告说，酒精一旦进入了身体，肝脏便开始通过代谢反应来清除毒物。研究显示，大约50%的日本人和华人的酒精代谢酶系统出现故障，使其中间产物乙醛快速、大量积累。因此，他们喝了酒会更容易出现脸红、晕眩、作呕等征兆。对这些人来说，他们的唾液中的乙醛含量要比含有健全酶系统的人高出两倍至三倍。科学家相信，乙醛随着唾液经过喉咙组织时可能导致癌症。此外,科学家也说,口腔内的细菌也可能具有把酒精分解成乙醛的功能。因此，不注意口腔卫生的饮酒人士患上癌症的机率更高。乙醛除了使饮酒者对酒精更加敏感，并造成皮肤温度上升,面赤，心律和呼吸加快，血压降低，口干，喉紧，头痛，恶心等症状之外还能够造成脑损伤，心肌病(cardiomyopathy),胰腺炎(pancreatitis)和胎儿酒精综合症(fetalalcoholsyndrome)(Eriksson,2001)。乙醛还能够导致红血球异常(Latvalaeta/., 2001)。乙醛通过血液进入大脑,能够组织神经信号的传递，导致记忆丧失，行为运动失控(Larson,1992)。对酒精的耐受性受基因控制酒精在体内的代谢过程主要由肝中的乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)和醛类脱氢酶(aldehydedehydrogenase,ALDH)所制约，它们分别催化的化学反应如下：C2H5OH(酒精)+NAD+TCH3CHO(乙醛)+NADH+H+CHCH0(乙醛)+NAD++H2OTCH3COOH(乙酸)+NADH+H+第一个反应生成的乙醛可刺激肾上腺素、去甲肾上腺素等物质的分泌，引起面红耳赤、心率快、皮温高等症状。除了ADH/ALDH系统之外，微粒体乙醇氧化系统(microsomalethanoloxidizingsystem)也能够将乙醇氧化成乙醛，但在这个酒精代谢中的作用仅占五分之一左右。人类的乙醇脱氢酶(ADH)系统非常复杂，至少可以分成六类同工酶。I-V类ADH基因编码£卩，丫，冗,X型肽链，通过不同组合，它们可以形成至少八个同型或异型双体。I类ADH包括同工酶a,卩，y亚基,分别由ADH】，ADH2,ADH3基因位点编码，11类ADH包括冗亚基，由ADH4基因位点编码。这两类ADH都是肝脏酶。III类ADH包括x型肽链，由ADH5基因位点编码，是一个甲醛脱氢酶。IV类ADH包括q型肽链(PID：g6137442)，由ADH?基因位点编码,主要在胃和食道器官表达。V类ADH由ADH基因位点编码，但在人体内尚未检查到它的6活性。对VI类ADH的研究不多。在人类中，1类ADH在乙醇代谢中起主要作用。成人主要是B链二聚体，来自ADH2基因。ADH2具有多态性，大多数白种人为ADH2-1，由B1B1组成;而90%黄种人为ADH2-2由B1的变异肽链B2(47位精氨酸一组氨酸)组成(B2B2)(jomvalletal.,1984;Matsuoetal.,1989)。B2B2的酶活性约为BIB1的100倍,故大多数白种人在饮洒后产生乙醛较慢,而黄种人积蓄乙醛速度较快(Thomassoneta/.,1995；Yineta/.,1992)。人体内有十多种醛类脱氢酶(ALDH)(Vasilioueta/．,2000;Yoshidaeta/．,1998)。根据对乙醛的Km值高低，可以把人类ALDH同工酶分成两大类：对乙醛的£值高的(超过毫摩尔浓度，也就是只有在乙醛浓度高时才有催化作用)和对乙醛的Km值低的(微摩尔浓度，在乙醛浓度低时即有催化作用)。前者包括ALDH3(K=83mM)和ALDH4(Kmm=5mM)；后者包括ALDH1(K=30yM)和ALDH2(K=3«M)(Yineta/.,mm1993)。所以，人体内的乙醛氧化主要由ALDH1和ALDH2来完成，而ALDH2对乙醛的活性较ALDH1活性高出约10-50倍(Vasiliouetal.,2000;Yoshida,1998)OALDH1存在于细胞浆内,ALDH2存在于线粒体内。ALDH2由54kDa的亚基形成四聚体。多数东方人种的ALDH2基因为突变型(ALDH2*2，即ALDH2的第487个氨基酸由谷氨酸(E)变成了赖氨酸(K)。这导致ALDH2*2丧失了脱氢酶的活性(Yoshidaetal.,1984;YoshidaandDave,1985;Farresetal1994)。黄种人中有3种乙醛脱氢酶表现型：普通型，ALDH1+ALDH2*1，约占人口总数的50%;“非经典型atypical”，有ALDH1+ALDH2*2，约占人口总数的50%；3，罕见的“非经典型”，仅有ALDH2无ALDH1，只在个别日本人中发现。几乎所有的白种人都为普通型(ShibuyaandYoshida,1988；Thomassonetal.,1994;Yineta. 1992)。因此，可以说黄种人较白种人易产生酒精中毒的原因是遗传因素决定的。由于黄种人的ADH活性高，饮酒后乙醇很快被氧化成乙醛,而由于ALDH的活性低，使乙醛迟迟不能够被氧化成乙酸，所以产生酒后的诸多中毒症状(Yineta.1992)。酒精中毒的基因补救人体排除酒精的通道有肺脏(呼吸)、肾脏(排尿)和肝脏(代谢)，其中90-98%是通过肝脏内的代谢来完成的。酒精在被饮用之后,要经过口腔、食道、胃和小肠,然后进入血液,其中70-80%以上在肠腔内进入血液，20-30%左右从胃脏进入血液，通过口腔和食道进入血液的仅占极少部分。血液中的乙醇被运输到肝脏,转化成乙酸,后者最终被分解成二氧化碳和水。酒精在血液中消失的速度为每小时100-200毫克／公斤体重,一个75公斤体重的健康成人每小时能够代谢7.5-15克乙醇。除了在肝脏代谢之外,乙醇在从进入口腔到被血液吸收这个过程中被氧化叫做“第一通道代谢("first—pass"metabolism”)，主要通过口腔、食道、胃肠内的乙醇氧化酶系统将乙醇氧化。人类的第四类乙醇脱氢酶a-ADH就主要存在于上食道的黏膜，而不存在于肝内(Farresetal.,1994)og-adh是所有ADH中活性最高的(MorenoandPares, 1991;Morenoetal.， 1994;Farresetal.,1994)，但由于总量少(大约10微克／克组织)，加上乙醇迅速进入血液,所以胃内乙醇氧化在酒精代谢中所起的作用不是很大(Pares,1993)o很显然，消除酒精毒害的最好办法就是在其进入血液之前，将它氧化成没有毒性的乙酸。不过，消化系统的环境十分不利于乙醇代谢酶。首先，胃液的酸殓度(pH值)在1-3左右，平均值大约是2,肠腔(intestinallumen)的pH值可能高达8-9左右。因此，细胞内的Adh和ALDH在胃中几乎不起作用。肠胃液体中，除有少量的ADH夕卜，很少有ALDH的存在。其次，胃液中的离子(特别是胆汁盐)对乙醇氧化酶(ADH和ALDH)也有抑制作用。再其次，胃肠液中NAD+的含量很少，乙醇的氧化缺乏电子受体，无法进行。最后，胃液中的蛋白酶更是其他酶的天敌,在它们能够发挥作用之前就已经被分解成氨基酸了。所以,要通过口服夕源乙醇氧化酶来治疗乙醇代谢基因的缺陷,首先要克服上面的问题。另外还要考虑的问题就是外源蛋白在生产加工过程中的稳定性。比如人类ALDH2*1在细胞夕的稳定很差，经过加工之后,绝大部份生物活性已经丧失殆尽。

乙醇氧化酶系统存在于几乎所有的生物中。从耐酸、耐硷、耐高温的生物中把相应的基因克隆出来,让它们在生物反应器中超量表达，经过简单纯化，就能够得到大量、纯净的酶制品由于它们来自的生物在高温和酸硷环境中生长,所以这些酶一般也能够在相同的环境中起作用。根据它们的特性，可以把它们制成酸性和硷性饮料或汤料，在饮酒时同时饮用,就能够将酒精代谢产生的乙醛氧化成乙酸,防止其对人体的毒害。硫叶菌（Sulfolobussolfataricus）是一种从硫矿中分离出来的古细菌，最适生长温度是80°C，最适pH值在2—4之间（Charleboisetal.,1998;Sheeta/.,2001）。硫叶菌的基因组已经全部解码（Sheeta/.,2001）,其中有13个基因编码乙醇脱氢酶，1个基因编码醛类脱氢酶。对这些基因进行序列分析，发现其中的Adh3编码的蛋白质具有典型的乙醇脱氢酶结构域，并与人类的第四类乙醇脱氢酶-ADH有45%的相似性；A[dhT基因编码的醛类脱氢酶与人类的ALDH2有54%的相似性（见下）。同样，在嗜殓耐高温枯草杆菌Bacillushalodurans的基因组中，有四个乙醇脱氢酶基因，11个醛类脱氢酶基因，后者中的两个，dhaS和aldA与人类的ALDH2有很高的相似性。项目内容利用基因工程手段克隆人类及嗜酸嗜硷耐高温细菌的乙醇、乙醛脱氢酶基因，使其在大肠杆菌和酵母细胞中超量表达，经过纯化之后,与辅剂、添加剂制成片、丸、散、胶囊、汤料等制剂，供消费者在饮酒的同时服用，加速消除体内乙醇、乙醛,达到保肝健体的作用。细菌乙醇、乙醛脱氢酶在大肠杆菌中的超量表达将嗜酸硫叶菌和嗜殓枯草杆菌的乙醇、乙醛脱氢酶基因克隆到表达载体中，然后转化大肠杆菌工程菌株。在没有诱导目的基因表达的生长环境下（泳道1-3），目的基因没有表达。当加入诱导剂之后（泳道4-6），目的基因超量表达，目的蛋白质（箭头所指）可达细菌蛋白质总量的50%以上。泳道1，4：硫叶菌乙醛脱氢酶基因克隆泳道2,5：枯草杆菌乙醛脱氢酶基因克隆泳道3，6：硫叶菌乙醇脱氢酶基因克隆泳道M：蛋白质分子量标记

技术路线安全性考虑：从理论上分析，蛋白质在肠胃消化系统中很快就会被蛋白酶分解成氨基酸,所以，除了少数毒素蛋白质外,绝大多数蛋白质作为食品服用是安全的。而微生物蛋白供人使用的例子更是多得举不胜举。比如，金黄葡萄球菌产生的葡激酶可以用来治疗心肌梗塞，病毒蛋白质制成的疫苗可以直接注射到人的体内。人类食用苏芸金杆菌的B.t.毒素转基因植物，也没有发现有不良后果。目前已有大量的实验数据证明Bt蛋白只对少数目标昆虫有毒，对人畜绝对安全。我们选用的蛋白质分别来自人类和两个细菌。人类蛋白质对人类的安全性自不待言,而这两个细菌都不是动物或人类的病原菌,并且他们都需要在高温和极端酸硷度的环境下才能够生长,所以他们本身并不能够对人体造成危害。况且,我们只是从细菌基因组编码的上千个蛋白质中选出一个,因此更没有病原菌的问题。我们克隆的这几个细菌蛋白质，与人的同类蛋白的相似性都接近或超过了50%，并且与毒素蛋白质没有任何相关性。我们选择的反应器是国际通用的生物反应器，其中啤酒酵母对人类不仅没有任何毒害，而且是营养丰富的食品和食品添加剂。啤酒酵母是非常好的营养物质，含有大量优质蛋白质,人体消化吸收率可达90%以上;维生素B十个组分达8.5mg/g；维生素D达0.008g/g；无机盐磷、钙、钾、铁、锌、铬、镁等适量。发达国家早已全部回收作为营养品食用。例如,日本就利用干燥的啤酒酵母制造减肥食品。我们使用的大肠杆菌生物反应器是生物工程菌,都不含有大肠杆菌毒素基因。它的表达效率可高达50%，目标蛋白质经一次纯化即可达到95%以上的纯度。并且，在纯化目的蛋白的过程中,我们都使用60—80<C高温处理，大肠杆菌蛋白质在该条件下，100%被钝化。经济效益分析酒精中毒严重威胁人民的身心健康。中国有3亿人饮酒,其中一半携带有缺陷型乙醛脱氢酶基因。即使以十分之一酒民每人每年购买5元的产品计,市场规模即可达到1.5亿元/年以上，再加上作为保健预防用购买的消费者,市场前景极为可观。而在达到批量生产后,生产成本约为销售价格的5-10%。参考文献沈渔邨。近年来国内有关酒依赖和慢性酒中毒的流行病学调查资料。《中国心理卫生杂志》,1987;(6)：251沈渔邨。21世纪中国面临的精神卫生挑战。《中华精神科杂志》1996年第1期。苏素花。7例急性乙醛中毒及其抢救治疗报告《中国工业医学杂志》2001年10月第14卷第5期。284页。BrienJF,LoomisCW.1983.Pharmacologyofacetaldehyde.CanJPhysiolPharmacol.61,1-22．CharleboisRL,SheQ,SprottDP,SensenCW,GarrettRA.1998.Sulfolobusgenome:fromgenomicstobiology.CurrOpinMicrobiol.1,584-8.ChrysanthyIkonomidou,PetraBittigau,MasahikoJ.Ishimaru,DavidF.Wozniak,ChristianKoch,1KerstinGenz.2000.Ethanol-InducedApoptoticNeurodegenerationandFetalAlcoholSyndrome.Science287,1056-1060.CunninghamCC,BaileySM.2001.Ethanolconsumptionandlivermitochondriafunction.BiolSignalsRecept.10, 271-82.ErikssonCJ.2001.Theroleofacetaldehydeintheactionsofalcohol(update2000).AlcoholClinExpRes25(5SupplISBRA)：15S-32S.FarresJ,WangX,TakahashiK,CunninghamSJ,WangTT,WeinerH.1994.Effectsofchangingglutamate487tolysineinratandhumanlivermitochondrialaldehydedehydrogenase.Amodeltostudyhuman(Orientaltype)class2aldehydedehydrogenase.JBiolChem. 269,13854-60.FarresJ,MorenoA,CrosasB,PeralbaJM,Allali-HassaniA,HjelmqvistL,JornvallH,ParesX.1994.AlcoholdehydrogenaseofclassIV(sigmasigma-ADH)fromhumanstomach.cDNAsequenceandstructure／functionrelationships.EurJBiochem.224,549-57.HomannN,TillonenJ,MeurmanJH,RintamakiH,LindqvistC,RautioM,Jousimies-SomerH,SalaspuroM.2000.Increasedsalivaryacetaldehydelevelsinheavydrinkersandsmokers:amicrobiologicalapproachtooralcavitycancer.Carcinogenesis21(4):663-8.HomannN,TillonenJ,RintamakiH,SalaspuroM,LindqvistC,MeurmanJH.2001.Poordentalstatusincreasesacetaidehydeproductionfromethanolinsaliva:apossiblelinktoincreasedoralcancerriskamongheavydrinkers.OralOncol37, 153—8.JaumeFarresetal.,EnzymologyandMolecularBiologyofCarbonylMetabolism5,EditedbyH.Weineretal.,PlenumPress,NewYork, 1995,pp331—339.Jornvall,H.,Hempel,J.,Vallee,B.L.,Bosron,W.F.andLi,T.K.1984.Humanliveralcoholdehydrogenase:aminoacidsubstitutioninthebeta2beta2Orientalisozymeexplainsfunctionalproperties,establishesanactivesitestructure,andparallelsmutationalexchangesintheyeastenzyme.PNAS81,3024-3028.LatvalaJ,ParkkilaS,MelkkoJ,Niemela0.2001.Acetaldehydeadductsinbloodandbonemarrowofpatientswithethanol-inducederythrocyteabnormalities.MolMed7(6):401—5.Lieber,C.S.2000.ALCOHOL：ItsMetabolismandInteractionWithNutrients.Annu.Rev.Nutr.20:395—430.MartinR.Walesetal.,EnzymologyandMolecularBiologyofCarbonylMetabolism3,EditedbyH.Weineretal.,PlenumPress,NewYork,pp.337-345(1990).MatsuoY,YokoyamaR,YokoyamaS.1989．Thegenesforhumanalcoholdehydrogenasesbeta1andbeta2differbyonlyonenucleotide.EurJBiochem.183,317-20．MorenoA,ParesX．1991.Purificationandcharacterization ofa ne walcohol dehydrogenasefromhumanstomach.JBiolChem．266,1128-33.MorenoA,ParesA,OrtizJ,En riquezJ,ParesX.19 94. 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