紫外可见吸收光谱分析法

第五章

紫外-可见吸收光谱分析分子光谱之一根本要求：了解紫外-可见吸光光度法的特点，光的根本性质，物质对光的选择性吸收，吸收曲线。掌握朗伯-比耳定律，以及运用朗伯-比耳定律定量分析的方法。掌握紫外-可见分光光度计的根本结构、工作原理，了解其主要部件的根本性质和工作原理。掌握测量条件的选择以及显色反响选择的方法。了解双光束分光光度法的原理和应用。了解双波长分光光度法的原理和应用。第一节概述

一、仪器分析方法分类〔回忆〕：电化学分析法光学分析法色谱分析法其它分析方法原子光谱法分子光谱法

X射线光谱法核磁波谱

紫外—可见光光谱法荧光光谱法红外吸收光谱法拉曼光谱法

本章是仪器分析课程中光分析方法的第一章，光分析方法中的一些根本理论、根本概念、根本专业术语，在本章中首次出现并应用。紫外－可见吸收光谱法历史较久远，应用十分广泛，与其它各种仪器分析方法相比，紫外－可见吸收光谱法所用的仪器简单、价廉，分析操作也比较简单，而且分析速率较快。在有机化合物的定性、定量分析方面，例如化合物的鉴定、结构分析和纯度检查以及在药物、天然产物化学中应用较多。光分析的根本过程：〔1〕能源提供能量；〔2〕能量与被测物之间的相互作用；〔3〕产生信号。根本特点：〔1〕所有光分析法均包含三个根本过程；〔2〕选择性测量，不涉及混合物别离〔不同于色谱分析〕；〔3〕涉及大量光学元器件。电磁幅射的波长分布γ射线：5～140pm

X射线：10－3～10nm光学区：10～1000μm

远紫外区：10～200nm

近紫外区：200～380nm

可见区：380～780nm近红外区：0.78～2.5μm中红外区：2.5～50μm远红外区：50～1000μm微波：0.1mm～1m无线电波：>1m紫外－可见吸收光谱是基于分子内电子跃迁，是分子光谱。电磁辐射的根本性质电磁辐射〔电磁波〕：以接近光速〔真空中为光速〕传播的能量；c=λν=ν/σE=hν=hc/λc：光速=2.998×1010cm·s；λ：波长；ν：频率；σ：波数；E：能量；h：普朗克常数＝6.624×10-34J·s电磁辐射具有波动性和微粒性；分子光谱〔带状光谱〕：基于分子中电子能级、振-转能级跃迁；紫外光谱法〔UV〕；红外光谱法〔IR〕；分子荧光光谱法〔MFS〕；分子磷光光谱法〔MPS〕；核磁共振与顺磁共振波谱〔N〕；不同物质具有不同的分子结构，对不同波长的光会产生选择性吸收，因而具有不同的吸收光谱。而各种化合物，无机化合物或有机化合物吸收光谱的产生在本质上是相同的，都是外层电子跃迁的结果，但二者在电子跃迁类型上有一定区别。有机化合物吸收可见光或紫外光，σ、π和n电子就跃迁到高能态，可能产生的跃迁有σ→σ*、n→σ*、π→π*和n→π*。各种跃迁所需要的能量或吸收波长与有机化合物的基团、结构有密切关系，根据此原理进行有机化合物的定性和结构分析。

无机络合物吸收带主要是由电荷转移跃迁和配位场跃迁而产生的。电荷转移跃迁的摩尔吸收系数很大，根据朗伯－比尔定律，可以建立这些络合物的定量分析方法。二、应用：1．定量分析：

有色物质→可见光区：340~800nm

对紫外线有吸收的无色物质→紫外光区：

200~340nm

灵敏度ppm，精密度RSD:0.5%二、应用：2．定性分析：提供某些分子的局部结构信息例：苯的B带吸收〔230~270nm间出现7个精细结构的峰〕

第二节吸收定律与光谱图一、朗伯—比耳定律㈠吸光度(A)的定义I0It当一束平行光通过均匀的溶液介质时，光的一局部被吸收，一局部被器皿反射。设入射光强度为I0，透射光强度为It。那么吸光度(A)表示物质对光的吸收程度，其定义为:一、朗伯-比耳定律㈡朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的根本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和根底。⒈当C采用重量单位时，吸收定律表达为:A=abc式中：a：吸光系数，L/g*cmb：光程，cmc：浓度，g/L

可知：A与c呈线形关系，为定量分析的理论依据一、朗伯—比耳定律2.当C采用摩尔浓度时，吸收定律表达为:

A=εbc

ε:摩尔吸光系数，L/mol·cmc:摩尔浓度，mol/L一、朗伯—比耳定律㈢透光率〔T〕I0It定义为：

那么：

应用：仪器的调整T〔%〕：0~100〔全吸收〕〔无吸收〕A：∞~0二、紫外-可见吸收光谱图定义：固定试样浓度和吸收池厚度，以吸收度〔或透光率〕对波长所作的曲线。[例]0.001mol·L-1高锰酸钾、重铬酸钾光谱图。扫描-胡罗卜素咖啡因阿斯匹林丙酮几种有机化合物的吸收光谱图。浓度与吸收曲线紫外-可见吸收光谱图的应用定量：一般总有一最大吸收峰，其对应波长称为最大吸收波长〔λmax〕,往往以λmax作为定量分析时的单色光波长，可最大限度地提高灵敏度。简单定性，答复“是不是〞的问题。第三节紫外-可见光分光光度计

一、分类单光束分光光度计双光束分光光度计

单波长分光光度计

双波长分光光度计可见光分光光度计

紫外-可见光分光光度计二、根本光路图三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕光源单色器样品室检测器显示三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕1.光源：提供稳定的复合光

可见光区：钨灯、碘钨灯。其辐射波长范围在320～2500nm。

紫外区：氢灯、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕2.单色器

作用：从光源的复合光中别离出所需单色光。组成：由色散元件和狭缝组成。光源单色器样品室检测器显示三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕2.单色器①色散元件作用：将复合光分解成连续单色光。A.棱镜〔靠折射作用分光〕可以得到波长非均匀分布的连续光谱，光强损失较大。400nm800nm三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕

棱镜（Prism）：棱镜的色散作用是基于构成棱镜的光学材料对不同波长的光具有不同的折射率。波长大的折射率小，波长小的折射率大。Cornu棱镜

b

Littrow棱镜三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800400500

600三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕光栅：在镀铝的玻璃外表刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。提供波长均匀分布的连续光谱，可用于吸收光谱的自动扫描。原理：利用光通过光栅时发生衍射和干预现象而分光.。光栅衍射示意图M1光屏透镜平面透射光栅出射狭缝M2三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕

ABCDd

P0距离相对强度P’112光栅例：7530型紫外—可见光分光光度计。步进马达带动光栅，得到匀速变化的单色光。光栅制作：机刻600～2880条/mm复制光栅〔照相，化学腐蚀〕三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕2.单色器②狭缝由锐边金属片组成A.入射狭缝：位于光源与色散元件之间。作用：是限制杂散光进入色散元件。B.出口狭缝：位于色散元件与吸收池之间。作用：把额定波长单色光别离出单色器。光源样品室检测器显示三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕2.单色器②狭缝

狭缝宽度可调

定性分析时，窄一点，单色光纯，但光强弱。

定量分析时，宽一点，灵敏度高。

例：7530型分光光度计0.2nm，1.0nm，2.0nm三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕3.吸收池〔也可称为比色皿、样品池〕作用：盛放试液。①材料

A.普通光学玻璃：用于可见光区，因为它吸收紫外光。

B.石英玻璃：用于紫外光区，亦可用于可见光区。三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕3.吸收池〔也可称为比色皿、样品池〕

②宽度：0.5cm，1cm，2cm③使用本卷须知固定使用同一比色皿，因为每个比色皿的壁厚、光程、吸光特性等不尽相同。三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕4.检测器一类光电转换元件。

常用类型有：①光电池②光电管③光电倍增管三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕4.检测器①光电池

SeFe(Cu)h

玻璃Ag(Au)透明膜-收集极塑料--对500~600nm光灵敏，用于可见光区。容易产生疲劳效应，便易。72G型光电比色计。

三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕4.检测器②光电管90VDC直流放大阴极R-+光束e阳极丝（Ni）抽真空灵敏度比光电池大例：721型可见光分光光度计三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕4.检测器③光电倍增管1个光子产生106~107个电子石英套光束栅极，Grill阳极屏蔽对光特别敏感，灵敏度比光电管高200倍。对供电量要求高，需要到达0.01～0.05%的稳定性。一种新型检测器：光电二极管阵列，PDASiO2窗p

型硅n型硅基pnpnpnpnpnpn0.025mm2.5mm侧视(crosssection)顶视(topview)光束512个1024个三、主要部件〔以单光束分光光度计为例〕5.显示器将检测器产生的光电流用直观的形式显示出来。例：72G型722型7530型

电表指针显示数字形式显示屏幕形式显示第四节测试条件一、分析波长1.一般情况下，选λmax作分析波长，以便获得最高的灵敏度。2.对于高浓度样品，为保证足够的工作直线的线形范围，可选用灵敏度较低的吸收峰波长。3.λmax受到其它波峰干扰时，可选用别的吸收峰波长。二、出口狭缝宽度最正确宽度的选择方法：在A不减小时的最大狭缝宽度。〔因为，在一定宽度范围内，A不变；过大时，由于干扰谱带或非吸收光出现在光谱通带内，A减小。〕三、适宜的吸收度范围根据吸收定律，A=0.4343时，吸收度测试量误差最小。实际工作中，将试样吸收度控制在0.2～0.8之间。控制方法：选择适宜的比色皿宽度，稀释待测样等。第五节试样体系条件的选择显色反响在分光光度分析中，利用显色反响把待测组分X转变为有色化合物，然后再进行测定。使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反响叫显色反响。mX〔待测物〕＋nR〔显色剂〕＝XmRn〔有色化合物〕显色反响主要有配位反响和氧化复原反响，其中绝大多数是配位反响。选择显色反响的一般标准1、灵敏度高选择较大(104～105)的显色反响。2、选择性好显色剂仅与被测组分显色而与其它共存组分不显色。防止共存组分干扰。3、有色物组成固定如：Fe3++磺基水杨酸→三磺基水杨酸铁(黄色)〔组成固定〕Fe3++SCN-→FeSCN2+、Fe(SCN)2+……〔组成不固定〕4、有色物稳定性高其它离子干扰才小。如三磺基水杨酸铁的Kf=1042,F-、H3PO4对它无干扰。5、显色过程易于控制而且有色化合物与显色剂之间的颜色差异应尽可能大。一、酸碱度①影响显色剂的平衡浓度和颜色

HR⇌H++R-nR-+Mn+⇌MRn②影响被测物质的存在状态

pH升高，M→M(OH)……M(OH)n甚至↓③影响络合物的组成及颜色在pH＝2～3Fe(ssal)+

紫红色在pH＝4～7Fe(ssal)22-

棕橙色

在pH＝8～10Fe(ssal)3

黄色在pH>12Fe(OH)3

沉淀一、酸碱度pH会影响显色剂的解离，被测离子的水解等，所以，要选择最正确酸度，并用缓冲液来控制。ApH选择最正确pH值方法：固定试液浓度，改变pH值测A，做A-pH图，找出对A影响最小的pH值范围。二、显色剂浓度1、显色剂的用量显色反响一般可表示为M+R⇌MR显色剂用量，适当过量。Aab(1)CRa(2)CR(3)CR二、显色剂浓度2、最正确浓度选择作A-C显色剂图，找出对A影响最小的浓度范围。AC显色剂三、显色时间显色反响有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的显色反响需放置不同的时间，并在一定的时间范围内进行比色测定。试液自参加显色剂等且定容后开始计时，测A，制作A－t曲线，(2)、(3)用秒表控时t-minab(1)(3)t-mint-mina(2)三、显色时间试液颜色常随时间而变化。

1.找到对颜色变化影响最小的时间段。2.每个试液都要有相同的显色时间。A

t四、温度有些反响需要加热。有些显色剂或有色配合物在较高温度下易分解褪色。此外温度对光的吸收及颜色深浅也有影响，要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。固定其它条件，改变T，作A~T曲线，寻找适宜反响温度。TATATATATA四、温度温度能影响显色反响的速度，影响颜色的稳定性。据此可以找到最正确的温度。有些显色反响受温度影响较大，这时候，要控制恒定的温度。5、溶剂：有机溶剂可降低有色化合物的离解度。适宜的外表活性剂可增溶、增敏、增稳。6、共存干扰离子的影响及消除：包括：正干扰〔共存离子本身有色or与显色剂反响，在测量条件下有吸收〕和负干扰〔共存离子引起显色反响不完全〕消除干扰的方法(a)控制酸度； (b)参加掩蔽剂；(c)改变干扰离子价态； (d)别离干扰离子。实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁

铁盐标准溶液0.0100mg/mL0.1%邻二氮菲〔又称邻菲咯琳〕水溶液1%盐酸羟胺水溶液HAc-NaAc缓冲溶液〔pH=4.6〕称取136g优级纯醋酸钠，加120mL冰醋酸，加水溶解后，稀释至500mL实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁橙红色配合物的最大吸收波长在508nm处，摩尔吸光系数ε508=1.1×104，反响的灵敏度、稳定性、选择性均较好。此反响可用于微量Fe2+的测定，如果铁以Fe3+的形式存在，那么应预先参加复原剂盐酸羟胺或对苯二酚将Fe3+复原成Fe2+。4Fe3++2NH2OH—→4Fe2++N2O+4H++H2O羟胺实验：邻二氮菲分光光度法测定微量铁

Bi3+、Cd2+、Hg+、Zn2+、Ag+等离子与邻二氮菲生成沉淀；Cu2+、Co2+、Ni2+等离子那么形成有色配合物，因此，当这些离子共存时，应注意它们的干扰。铝和磷酸盐含量大时，使反响速度慢，CN－存在将与Fe2+生成配合物，严重干扰测定，需预先除去。酸度高时，反响进行慢；酸度太低，那么Fe2+水解，影响显色，测定时的酸度是控制在pH=4-6。第六节定量分析法定量分析方法：标准曲线法BlankStandardSampleSample一、单组分的定量分析

〔测定样品中某一种成分的含量〕1.工作曲线法〔适用组成较简单的、批量的样品〕依据：A-C呈线性关系，作A-C曲线。⑴配制一系列待测成分的标准溶液C1C2C3C4C5⑵测出相应的吸光度A1A2A3A4A5BlankStandardSampleSample⑶建立工作直线〔A→C〕①作图法②回归法⑷测量待测样品，得A样①从工作直线上找到待测成分的浓度C样②由回归方程计算出C样2.增量法〔适用于组成较复杂的样品〕①

取假设干份等体积待测液。②

参加与待测液等体积的一系列标准溶液。③

作A-C标曲线，此线与C标轴交点即为C样。C0=0〔试剂空白〕等体积标液等体积待测液C0C3C2C1C4理论依据：A=εbc=εb(C样+C标)当A=0时，C样=-C标方法特点：适用于组成较复杂的样品，对于批量样品较麻烦。AC标0〔C0〕-C样二、多组分同时测定

〔同时测定一个样品中的几个组分〕溶液的总吸光度等于各组分的吸光度之和：

A=A1+A2+A3+……+An吸收峰互不重叠A、B两组分的吸收峰相互不重叠，那么可分别在A、B处用单组分含量测定法测定组分A和B。二、多组分同时测定

〔同时测定一个样品中的几个组分〕〔1〕n个波长处分别测定样品的吸光度。〔假设测定n个组分，一般选择各个组分的λmax〕〔2〕根据吸光度的加和性建立n个方程，解联立方程，可得n个组分的浓度。原理：吸光度加和性例：同时测某样品中二个组分分别在λ1、λ2处测样品的吸光度A1、A2。〔设定光程b=1cm〕λ1:A1=ε11C1+ε12C2λ2:A2=ε21C1+ε22C2εij：波长i处，j组分的摩尔吸光系数。文献，也可通过纯组分的工作直线的斜率求得。例：同时测某样品中三个组分分别在λ1、λ2、λ3处测样品的吸光度A1、A2、A3。〔设定光程b=1cm〕λ1:A1=ε11C1+ε12C2+ε13C3λ2:A2=ε21C1+ε22C2+ε23C3λ3:A3=ε31C1+ε32C2+ε33C3分光光度计的类型按光束分单光束分光光度计722、721、723、752双光束分光光度计Jasco-UV/VISUV-2450/2550760CRT单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示第七节双光束分光光度计的应用

应用：能克服光源不稳定造成的误差

一、光路图

I0I0I0I1I2样品参比切光器单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器二、工作原理

参比：样品：那么：

作ΔA-C工作直线，定量。由于ΔA与I0无关，所以，能够克服I0不稳定所造成的误差。

第八节双波长分光光度计的应用

特点：能消除共存干扰组分的影响；能消除浑浊试样的干扰；能用于高浓度试样的测量。属于背景吸收一、光路图

结构特点：二个单色器.显示器切光器（使光束交替通过）二、工作原理

λ1：A1=ε1bc+As1〔As1：λ1处的背景吸收〕λ2：A2=ε2bc+As2〔As2：λ2处的背景吸收〕如果As1=As2那么△A=A2-A1=ε2bc-ε1bc+As2-As1=〔ε2-ε1〕bc△A与c呈线性关系，可定量。.显示器λ1λ2三、双波长分光光度法对于吸收曲线有重叠的单组分(显色剂与有色络合物的吸收光谱重叠)或多组分(两种性质相近的组分所形成的有色络合物吸收光谱重叠)试样、混浊试样以及背景吸收较大的试样，由于存在很强的散射和特征吸收，难以找到一个适宜的参比溶液来抵消这种影响。利用双波长吸光光度法，使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者