依据蛋白大小利用电流把细胞或组织中分离开并使用抗体来检测讲座cst wbihcif

WesternBlotWesternBlot©2013CellSignalingTechnology,2WesternBlot重点步WesternBlot重点步抗体孵育/检3©2013CellSignalingTechnology,•4©•4©2013CellSignalingTechnology,•Loading对•5©2013CellSignalingTechnology,Loading分子量Beta•Loading对•5©2013CellSignalingTechnology,Loading分子量Beta会导致在一些特定细胞类型中GAPDH的Lamin11.样品11.样品2.上样与电5.抗体孵育和检6©2013CellSignalingTechnology,11）•CellLysisBuffer(10X)11）•CellLysisBuffer(10X)ChapsCellExtractBuffer(10X)#9852：非变性条件下对细胞进行裂解，推荐用于利用的sase检测的细胞质细胞裂解物的制备；RIPABuffer(10X)-----用于细胞和组织的裂解••7©2013CellSignalingTechnology,12）••••PMSFProteaseInhibitorCocktail(100X)-----AEBSF,Aprotinin,Bestatin,E64,Leupeptin,PepstatinA；PhosphataseInhibitorCocktail(100X)#5870；-----Sodiumfluoride,12）••••PMSFProteaseInhibitorCocktail(100X)-----AEBSF,Aprotinin,Bestatin,E64,Leupeptin,PepstatinA；PhosphataseInhibitorCocktail(100X)#5870；-----Sodiumfluoride,sodiumpyrophosphate,β-glycerophosphate,sodiumorthovanadate；Protease/PhosphataseInhibitorCocktail(100X)#5872-----上述蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合8©2013CellSignalingTechnology,抑制所抑制的蛋白酶/磷酸裂解缓冲液中的胰酶，糜蛋白酶，血浆2溶酶体1--10Pepstatin天冬氨1天冬氨1需要镁和锰离子的金属蛋白1--5需要钙离子的金属蛋白1Na丝氨酸和苏氨酸5--10酪氨酸1丝氨酸和苏氨酸1--2β-丝氨酸和苏氨酸1--21 3）从细胞或组织里提取裂怎1 3）从细胞或组织里提取裂怎样才能获得高质量的裂解物••9©2013CellSignalingTechnology, +sorbitolSonicatedUnsonicated1II.1II.©2013CellSignalingTechnology, 14）蛋白浓14）蛋白浓度CST蛋白浓度测定试BCAProteinAssayKit©2013CellSignalingTechnology,15)制备样品的15)制备样品的上变性剂(SDS)和煮沸DTT或β-ME用于打开二硫键BlueLoadingBufferPackRedLoadingBufferPack©2013CellSignalingTechnology,1©2013CellSignalingTechnology,样品制备过程中的一些要点与建议1©2013CellSignalingTechnology,样品制备过程中的一些要点与建议21.样品21.样品2.上样与电3.转4.封5.抗体孵育和检©2013CellSignalingTechnology,©2013CellSignalingTechnology,©2013CellSignalingTechnology,1）20--50ug总蛋白或100ng纯蛋白，可根据蛋白表达水Marker,BroadRange(PremixedFormat)#7720ProteinLadderMarker,BroadRange(PremixedFormat)#7720ProteinLadder©2013CellSignalingTechnology,Tris-GlycineSDSRunningBuffer(10X)©Tris-GlycineSDSRunningBuffer(10X)©2013CellSignalingTechnology,31.样品31.样品2.上样与电3.转4.封5.抗体孵育和检©2013CellSignalingTechnology,3NitrocelluloseSandwiches膜尺寸：7X8.5cm孔大小：0.2μm，结合能力：903NitrocelluloseSandwiches膜尺寸：7X8.5cm孔大小：0.2μm，结合能力：90©2013CellSignalingTechnology,分子胶浓转膜时间（小时140-2.0-80---1.5-25---15--©2013CellSignalingTechnology,NC 尼龙 PVDF高高高低低80－110>400125－200ug/cm2（适合于©2013CellSignalingTechnology,NC 尼龙 PVDF高高高低低80－110>400125－200ug/cm2（适合于无无有、©2013CellSignalingTechnology,转膜具体要点和©2013CellSignalingTechnology,转膜具体要点和建大分子量用4℃湿转过夜代替半干法小分子量保持甲醇浓度在对于非常小的蛋白，不要用半干法膜的方向1）转移后剪角做标记，分清正反面；用铅笔做记号或电泳时Marker转膜后背可以换成NC膜以减少背景；转膜时污滤纸的大41.样品41.样品2.上样与电3.转4.封5.抗体孵育和检©2013CellSignalingTechnology,4CST建议用含5脱脂奶粉的TBST（ECL法检测或含5脱脂奶粉的TBS（荧光法检测）室温1小时进行封闭•4CST建议用含5脱脂奶粉的TBST（ECL法检测或含5脱脂奶粉的TBS（荧光法检测）室温1小时进行封闭••••PBS-PBS-1X（pH7.2，灭菌•©2013CellSignalingTechnology,51.样品51.样品2.上样与电3.转4.封5.抗体©2013CellSignalingTechnology,5一抗(CST建议用含5BSA5%脱脂奶粉的TBST5一抗(CST建议用含5BSA5%脱脂奶粉的TBST，参见抗体说明书)4°C过夜孵育；二抗(CST建议用含5%脱脂奶粉的TBST稀释室温1小时••©2013CellSignalingTechnology,一抗I）稀释缓冲 依赖于特定一抗I）稀释缓冲 依赖于特定的抗55©2013CellSignalingTechnology,II）孵 过夜孵育会改善抗体结16hr,2hr,II）孵 过夜孵育会改善抗体结16hr,2hr,Akt---+++---+++©2013CellSignalingTechnology,inCSTprotocol)inCSTprotocol)5sec,4-20%gel5sec,4-20%Protein4E-BP1©2013CellSignalingTechnology,COS-二抗Anti-rabbitIgG,二抗Anti-rabbitIgG,HRP-linkedAntibodyAnti-biotin,HRP-linkedAntibody#7075；Anti-mouseIgG,HRP-linkedAntibody#7076；Anti-RatIgG,HRP-linkedAntibody#7077；Streptavidin-HRP•••••••••DyLight®680和800接合的（适用于荧光Western和免疫荧光Anti-mouseIgG(H+L)(DyLight®800Conjugate)Anti-mouseIgG(H+L)(DyLight®680Conjugate)#5470；Anti-rabbitIgG(H+L)(DyLight®800Conjugate)#5151；Anti-rabbitIgG(H+L)(DyLight®680Conjugate)©2013CellSignalingTechnology,•••MouseAnti-rabbit•••MouseAnti-rabbitIgG(Light-ChainSpecific)(L57A3)mAbMouseAnti-rabbitIgG(ConformationSpecific)(L27A9)mAbMouseAnti-rabbitIgG(ConformationSpecific)(L27A9)mAb(HRPConjugate)Anti-rabbitIgG,AP-linkedAntibody#7054;Anti-mouseIgG,AP-linkedAntibody#7056;Anti-biotin,AP-linkedAntibody#7055;Beads接合的Anti-mouseIgG(H+L),F(ab‘)2Fragment(SepharoseBeadConjugate)Anti-rabbitIgGF(ab‘)2Fragment(SepharoseBeadConjugate)#6990；Streptavidin-HRP#3999••••••©2013CellSignalingTechnology,二 在较强的封闭剂中稀释二抗可以降低二 在较强的封闭剂中稀释二抗可以降低应根据操作手册的建议使用二抗用牛奶稀释二抗可以降低背–+–+©2013CellSignalingTechnology,免疫沉淀二抗免疫沉淀二抗选检化学发光 提供简便的使检化学发光 提供简便的使155 20XLumiGLO®Reagentand20XPeroxideSignalFire™ECLReagent#6883（可用于检测皮克数量级的蛋白©2013CellSignalingTechnology,荧光 提供了数荧光 提供了数字储存和定量的方便©2013CellSignalingTechnology,WB相关试WesternBlottingWB相关试WesternBlottingApplicationSolutionsKit©2013CellSignalingTechnology,无信高背无信高背©2013CellSignalingTechnology,©2013CellSignalingTechnology,原建一抗与二抗不匹©2013CellSignalingTechnology,原建一抗与二抗不匹1）一抗不识别目的种属的蛋检查抗体的说明书，适用范围内是否包含目的使用阳性对照来检查抗体质降低抗体稀释倍数，增加抗体浓度封闭剂与一抗有交叉反1）每个泳道加入20-30ug制备样品要使用蛋白酶抑制物及使用蛋白转膜转移前膜是否用甲醇浸泡过膜过度洗1）叠氮钠抑制二抗活1）©2013CellSignalingTechnology,©2013CellSignalingTechnology,©2013CellSignalingTechnology,原建©2013CellSignalingTechnology,原建使用未传代或传代次数较少的细胞系进行样品制备蛋白本身有很多修查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰蛋白被消化或者降蛋白样品确保未被污染，确保含有蛋白酶抑制一抗或二抗浓度降低抗体充分洗涤带(预测分子量:55kDa)©2013CellSignalingTechnology,带(预测分子量:55kDa)©2013CellSignalingTechnology,使用蛋白酶抑拖尾使用蛋白酶抑拖尾：样品溶 电泳中 电泳中条带两边扩散：加样量过多条带向上弯曲（条带呈笑脸状）：凝胶制备不均匀，中间冷却不好，制胶条带向上弯曲（条带呈笑脸状）：凝胶制备不均匀，中间冷却不好，制胶30%丙烯酰胺溶液条带向下弯曲（︵条带呈免疫组免疫组织化学（IHC）实验原理及要点分©2013CellSignalingTechnology,免疫组织化学免疫组织化学（IMMUNOHISTOCHEMISTRY，IHC)免疫组织化学免疫组织化学（IMMUNOHISTOCHEMISTRY，IHC)，使IHC-利用石蜡IHC-利用石蜡包埋组织切片进行的IHC-利用冷冻切片进行的IHC主要步IHC主要步样品制脱蜡及水抗原修透明和封ImmunohistochemistryImmunohistochemistryTipsandTricksAvideoseminardiscussingbestpracticesforimmunohistochemistryusing-embeddedsamples.SpecificIHCexamplesareclearlydiscussedtoexplainhowthechoiceofreagentcanimpactresultsandhowtoperformathoroughvalidationofantibodyspecificityforIHCwhileavoidingerroneousconclusions,particularlywhenusingphospho-specificantibodies.10%中性福尔马林液10%中性福尔马林液IHC方法中绝大部分的组织固定都是用中性福尔马林样品制备－固定需注意的问样品制备－固定需注意的问©样品制备－脱样品制备－脱样品制备－透样品制备－透©样品制备样品制备©样品制备－切样品制备－切©贴片与烤贴片与烤©抗原检测准备：抗原检测准备：水化–在不同浓度的乙醇中浸泡而重新带入水针对同一靶蛋白的不同抗针对同一靶蛋白的不同抗体，其首选抗原修复方法不热修复ProteinaseKEnzymecocktailEGFReceptor(D38B1)XP®RabbitmAb内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶去除和封 内源性过氧化物酶灭活封闭：避免抗体的非特异性吸附，通常使用与二抗相同来源的血清进行封闭酪蛋白封闭液？会影响酪蛋白封闭液？会影响磷酸化抗体的识别酪蛋白封闭Phospho-HistoneH2A.X(Ser139)(20E3)RabbitmAb一抗稀一抗稀释SignalStain®AntibodyDiluent孵育条件一抗4°C孵育过也可以根据情况在室温进行快速染色2小时，需要摸索稀释倍数P-AktP-EGFRTop:Bottom:HCC827TBST-5%P-AktP-EGFRTop:Bottom:HCC827TBST-5%孵育条件的影14°CPhospho-4E-BP1孵育条件的影14°CPhospho-4E-BP1(Thr37/46)(236B4)RabbitmAb显色与观AVIDIN/BIOTINYLATEDHRPHRPHRP显色与观AVIDIN/BIOTINYLATEDHRPHRPHRPBIOTINYLATEDSECONDARYHRPHRPHRPPRIMARYPRIMARY显色试剂的影显色试剂的影响：生物素VS聚合利用Sox2(D6D9)XPRabbitmAb对石蜡包埋的人类肺部肿瘤进行IHC分一步法显色系BoostIHC一步法显一步法显色系BoostIHC一步法显色试剂的•色原/底SignalStain®DABPhospho-p44/42色原/底SignalStain®DABPhospho-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E)XP®RabbitmAb经过优化的配套试剂经过优化的配套试剂和操作步PLK1(208G4)RabbitmAb©2013CellSignalingTechnology,掌控您的IHC检测－IHC优掌控您的IHC检测－IHC优化试封闭TrisBufferedSalinewithTween20(TBST-10X)NormalGoatSerum抗体稀释SignalStain®AntibodyDiluentSignalStain®BoostIHCDetection(HRP,Mouse)显色底物试剂SignalStain®DABSubstrateKitIHC补充试抗体同型对Rabbit(DA1E)mAbIgGIHC补充试抗体同型对Rabbit(DA1E)mAbIgGXP®IsotypeControl#3900Mouse(G3A1)mAbIgG1IsotypeControl#5415P-S6(Ser240/244)PurifiedRabbitTestedat8IHC补充试SignalSlide®IHCPhospho-Akt(Ser473)IHCControls#8101Phospho-EGFIHC补充试SignalSlide®IHCPhospho-Akt(Ser473)IHCControls#8101Phospho-EGFReceptorIHCControls#8102Phospho-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)IHCControls#8103CleavedCaspase-3(Asp175)IHCControls#8104Phospho-Stat1/3/5IHCControls#8105PTENIHCControls#8106Phospho-ErbBFamilyIHCControls#8117Phospho-Met(Tyr1234/1235)IHCControls#8118CustomorderIHC总结提供的IHC试总结提供的IHC试©2013CellSignalingTechnology,IHCAntibodiesforCancerOvaryLiverMolecular#4060;RX-BMS-PF-Ki-IHCAntibodiesforCancerOvaryLiverMolecular#4060;RX-BMS-PF-Ki-RX-PF-TrastuzumabPD-L1(E1L3N)XP®RabbitmAbHighlysensitiveantibodydetectsendogenousproteinNoPD-L1(E1L3N)XP®RabbitmAbHighlysensitiveantibodydetectsendogenousproteinNocross-reactivitywithotherfamilymembersIHCstaining-IHCstaining-lungFluorescentstaining-FCanalysis-SUP-M2#13684(blue),isotypecontrol©2013CellSignalingTechnology,ALK相关产品是CST在肺ALKproductsfromCST’sALK相关产品是CST在肺ALKproductsfromCST’scontributionstotheresearch•FirstidentifiedtheexistofEML4-ALKinNSCLC:CellCST’scontributionstotheclinical•CSTALKXPmAbs(D5F3;D9E4)firstappliedforIHCsuperiortoDako(ALK1mouse)and(5A4Mino-KenudsonM,etal.ClinCancerRes.•CSTALKXPmAb(D5F3)IHCwaslaunchedinlate2012byRoche/VantanaforclinicalALKRxinEUregionandpossibleUSmarket.CST’sALKrelated•••ALKinhibitor:PathScan®RTKSignalingAntibodyArrayALKActivationAntibodySamplerKit(ALK,JAK2,JAK3,STAT3,STAT5,ERK1/2,AKT,Src,PLC-Υ1).PathScan®totalandPhospho-ALK(Tyr1586)SandwichELISAKitsALK(D5F3)XP®RabbitmAbALK(D5F3)XP®RabbitmAbALK(C26G7)RabbitmAb(SepharoseBeadConjugate)forIPALK(D5F3)-PEforflowcytometry•••••ALK(D5F3™)XP®RabbitROS1ALK(D5F3™)XP®RabbitROS1(D4D6™)RabbitmAbStainingisofFIG-ROS1fusion©2013CellSignalingTechnology,©©2013CellSignalingTechnology,免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）又称荧光抗体技免疫荧光技术（Immunofluorescence，IF）又称荧光抗体技IF-IF-IF-IF-样本制IF-样本制贴壁细胞需要提前在多孔培养板中的载玻片或盖玻片上培悬浮细胞建议使用细胞离心甩片机制备细胞爬将培养好的细胞表面液体吸干，覆盖2–3mm4%液（PBS配制石蜡包埋切片(IF-注意石蜡包埋切片(IF-注意：在此操作过程中，一定不要让片子干燥脱石蜡/水化二甲苯，5分钟，3100%，10分钟，3–dH2O5分钟，2抗原修复（使用CST抗体说明书中推荐的抗原修复液ForCitrate:Bringslidestoaboilin10mMsodiumcitratebufferpH6.0,thenmaintainatasub-boilingtemperaturefor10minutes.Coolslidesonbenchtopfor30minutes.ForEDTA:Bringslidestoaboilin1mMEDTApH8.0followedby15minutesatasub-boilingtemperature.Nocoolingisnecessary.冰冻切片(IF-冰冻切片(IF-用PBS配置的4%甲醛溶液浸泡切片室温下，固定15分钟用PBS润洗3次，每次5（二）①防止细胞从（二）①防止细胞从玻片上脱落②除去防碍抗原-抗体结合的类脂③使标本易于保存①不能损伤细胞内的抗原③应保持细胞和亚细胞结构④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细通透处通透处如Triton,NP-40,以及Tween20,Saponin,Digitoni