第6章 蛋白质的生物合成-1

蛋白质的生物合成第6章1引言第一节遗传密码第二节蛋白质的合成第三节蛋白质合成后的折叠和修饰第四节蛋白质的运输第五节蛋白质的降解本章主要内容：Proteinsynthesis2引言

Proteinsynthesis--------Introduction中心法则CentralDogmaDNARNAProteins3Proteinsynthesis--------Introduction蛋白质合成是细胞内最复杂的生物学事件之一。真核细胞中，总共有超过300种不同的大分子来参与蛋白质的合成。4Proteinsynthesis--------Introduction蛋白质合成消耗的能量占细胞内化学合成能量消耗的90%以上。在一个典型的细菌中，含有20,000核糖体,100,000相关蛋白和酶;200,000tRNAs。这些成分占细胞干重的35%以上！5Proteinsynthesis--------Introduction蛋白质的合成速度非常快，37℃时大肠杆菌平均每15分钟分裂繁殖一次，平均每秒中合成20个氨基酸！蛋白质的合成受到精密调节。蛋白质的合成、运输和降解处于一种动态平衡。6第一节遗传密码1.1遗传密码的破译1.2遗传密码的特点Proteinsynthesis--------GeneticCode7遗传密码是利用人工合成的mRNA作为模板破译的。Proteinsynthesis--------GeneticCode1.1遗传密码的破译20世纪60年代遗传密码破译之前，人们通过一系列的实验就发现：(1)遗传密码的读法是从mRNA的靠近5‘端的地方开始，按照顺序依次读取的。翻译是沿着mRNA从

5’到

3‘端的方向进行的，与蛋白质的N端到C端相对应。8Proteinsynthesis--------GeneticCode(2)密码子由3个核苷酸组成的三联体组成。(3)由4种核苷酸分子所组成的所有64种可能组合均用来编码氨基酸。由于氨基酸只有20种，所以密码子具有简并性。920世纪60年代，Nirenberg将大肠杆菌细胞用DNase

处理后得到的细胞裂解物设计成一种无细胞蛋白质合成体系。这种体系中，如果在这个体系中加入天然的或人工合成的mRNA，就可以合成出一定量的蛋白质。Proteinsynthesis--------GeneticCode10Proteinsynthesis--------GeneticCode利用一种酶，叫做多核苷酸磷酸化酶来生成模板，结果产生四种模板，即poly(A),poly(C),poly(U)和poly(G)。(同聚化mRNA模板)。Nirenberg用放射性同位素标记了1种氨基酸，做了20组平行实验。11结果，poly(U)的模板产生了多聚苯丙氨酸，

poly(A)产生多聚赖氨酸，

poly(C)产生了多聚脯氨酸，

poly(G)没有起作用。Proteinsynthesis--------GeneticCode这样历史上第1次破译出的3个遗传密码子。12用两种不同的核苷酸（例如U核G）混合物作为底物，利用多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase

)，可以合成这种模板。2种核苷酸相对浓度不同，产生的模板类型也不同。例如

U/G=0.76/0.24时，形成的产物三联体中，UUU数量最多，有

2U和1G的模板次之，1U和

2G的模板第三多。GGG最少。Proteinsynthesis--------GeneticCode随机共聚物模板（Randomco-polymers）13Proteinsynthesis--------GeneticCode随机共聚物模板（Randomco-polymers）通过这种方法，测定了许多氨基酸的密码子的组成。但是不能知道密码子的精确顺序。1420世纪60年代，人们发现使用的合成的三核苷酸可以吸附到核糖体上，并且结合在特殊的氨酰-tRNA上形成复合物。使用一种特殊的滤膜，只有核糖体、三联体密码和氨酰tRNA

形成的复合物才能被滞留在膜上。Proteinsynthesis--------GeneticCode人工合成的三核苷酸15这样，通过使用化学方法合成的三核苷酸作为模板，大约有50个密码子得到破译。

Proteinsynthesis--------GeneticCode16有确定重复顺序，长度为2-4个的多聚核苷酸模板模板

(UUC)n,(AAG)n,(UUG)n,……(UAUC)n,(UUAC)n,……..产物(Phe)n,(Ser)n,(Leu)n(Lys)n,(Arg)n,(Glu)n(Leu)n,(Cys)n,(Val)n……(Tyr-Leu-Ser-Ile)n;(Leu-Leu-Thr-Tyr)n……通过这种实验，最终确定了61个密码子的确定的精确的序列。另外的3个密码子是终止密码子。Proteinsynthesis--------GeneticCode17标准遗传密码表Proteinsynthesis--------GeneticCode破解遗传密码*18Proteinsynthesis--------GeneticCodeDNA与蛋白质的共线性19Proteinsynthesis--------GeneticCodeDNA与蛋白质的共线性201.2遗传密码的特点（1）没有标点符号（2）一般没有重叠（3）密码子具有简并性（同义密码子）（4）密码子的第3位碱基具有摆动性。（5）起始密码子一般是AUG（6）密码子在生物中几乎是通用的（7）不同生物使用密码子有“偏爱性”

Proteinsynthesis--------GeneticCode21Proteinsynthesis--------GeneticCode三联体密码子没有标点符号，碱基的插入或缺失会导致结果产物蛋白质的不同22Proteinsynthesis--------GeneticCode线粒体内的非标准密码23Proteinsynthesis--------GeneticCode密码子的简并性24Proteinsynthesis--------GeneticCode病毒基因组中重叠基因的重叠密码子25Proteinsynthesis--------GeneticCode噬菌体φX174具有重叠基因26噬菌体中的重叠基因噬菌体φX174的基因组全长为

5386bp，编码

10种不同的蛋白质，分别命名为A到

K,大小如下所示。计算一下，编码这样的10种蛋白质需要的DNA是多少？结果与噬菌体的基因组所含有的DNA进行比较，如何解释？Proteinsynthesis--------GeneticCode蛋白质氨基酸数目蛋白质氨基酸数目

A455F427B120G175C86H328D152J38E91K5627Proteinsynthesis--------GeneticCode密码子的摆动性28Proteinsynthesis--------GeneticCode密码子的摆动性29Proteinsynthesis--------GeneticCode大肠杆菌中GUA既是终止密码子，有时又编码一种特殊的氨基酸－硒代半胱氨酸。这是发现的第21种氨基酸。30Proteinsynthesis--------GeneticCode第22种氨基酸---吡咯赖氨酸（pyrrolysine)2002年，科学家从一种产甲烷的细菌巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina

barkeri）发现这种特殊的氨基酸。这种细菌将本来该是终止密码子的UAG翻译成一种氨基酸。31Proteinsynthesis--------Mechanism第二节蛋白质的合成2.1翻译相关知识复习原核细胞多顺反子起始密码子前有SD序列真核细胞单顺反子无SD序列5’端多有帽子结构3‘端多有polyA32Proteinsynthesis--------MechanismSD序列33Proteinsynthesis--------Mechanism细菌中基因转录和蛋白质翻译是连续的34多聚核糖体(polysome)可提高翻译效率Proteinsynthesis--------Mechanism35Proteinsynthesis--------MechanismtRNA的三叶草型结构36Proteinsynthesis--------MechanismtRNA的三级结构37Proteinsynthesis--------MechanismtRNA中的反密码子与mRNA密码子的配对方式是反平行方式。38Proteinsynthesis--------GeneticCode密码子与反密码子配对时，在密码子的第3位上进行的碱基配对可能不完全遵守Watson-Crick定律。反密码子密码子

AUCGGUCUGAIACU39Proteinsynthesis--------Mechanism细胞中rRNA

的种类原核细胞真核细胞40原核细胞中，16SrRNA

在识别mRNA上的蛋白质合成起始位点方面有重要作用。Proteinsynthesis--------Mechanism回忆一下，有什么重要的作用？41核糖体由许多种类的蛋白质和rRNA组成Proteinsynthesis--------Mechanism42Proteinsynthesis--------Mechanism细菌核糖体的组成43Proteinsynthesis--------Mechanism椭圆球形，30S象一个胚胎，50S象一个有扶手的椅子，结合后接触的面有一个大的空隙，蛋白质的合成可能就在其中核糖体特点44Proteinsynthesis--------Mechanism核糖体的结构一直是结构生物学家的主要研究焦点之一，经过30年不懈的努力，核糖体的结构终于得到了解决。45Proteinsynthesis--------Mechanism46Proteinsynthesis--------Mechanism50S亚基47Proteinsynthesis--------Mechanism48Proteinsynthesis--------Mechanism49Proteinsynthesis--------Mechanism50Proteinsynthesis--------Mechanism51核糖体是一个核酶Proteinsynthesis--------Mechanism√最早提出者————Crick1968年√

Noller’s(Bartaetal.,1984)进行的亲和标记实验表明，23SrRNA

的一个保守环中的U2584

和U2585

距离P位点的CCA末端很近。√核糖体除去含有的许多蛋白质之后，仍然具有肽酰转移酶（

peptidyl-transferase

）活性。√

核糖体结构显示，在多肽合成的附近（18Å距离之内）没有蛋白质分子出现。522009年诺贝尔化学奖美国和以色列三位科学家因“对核糖体结构和功能的研究”（forstudiesofthestructureandfunctionoftheribosome）而获诺贝尔化学奖。Venkatraman

Ramakrishnan

ThomasA.Steitz

AdaE.Yonath

53氨酰-tRNA合成酶（Amino-acyl-tRNASynthetase）反应分2步:1氨基酸与ATP反应,形成

氨酰-AMP2氨酰-AMP的氨酰基转移到tRNA的3’端的CCA,形成

氨酰-tRNA

氨基酸+ATP+tRNA

氨酰-tRNA+AMP+PPi

每活化一个氨基酸,消耗掉2个高能键Proteinsynthesis--------Mechanism54Proteinsynthesis--------Mechanism氨基酸与ATP反应55Proteinsynthesis--------Mechanism氨酰-AMP的氨酰基转移到tRNA的3’端的CCA,形成氨酰-tRNA56Proteinsynthesis--------Mechanism携带了氨基酸的tRNA叫做氨酰-tRNA572对相应tRNA的特异性更高,如L-Ile-tRNA

Synthetase

可以激活Val(缬氨酸),但是不能与tRNAIle

结合.Proteinsynthesis--------Mechanism氨酰-tRNA合成酶的特点1对氨基酸有非常高的特异性3

只能激活L-氨基酸。58Proteinsynthesis--------Mechanism在蛋白质合成过程中没有校对步骤，这里的氨酰-tRNA合成酶对氨基酸和tRNA之间的严格配对，是保证蛋白质正确合成的关键。有人将这种氨酰tRNA合成酶与tRNA之间的这种相互作用关系，称为蛋白质合成过程中的“第二遗传密码”。这种关系比第一密码还要复杂。59a每个氨基酸必须连接在tRNA分子上才可以用于蛋白质的合成。Proteinsynthesis--------Mechanism氨基酸的活化具有重要意义b氨基酸与tRNA之间的连接键是高能键,用于氨基酸加入到新生的肽链末段形成肽键时使用。60Proteinsynthesis--------MechanismfMet-tRNAfMet

Met-tRNAmMet细菌的起始密码子AUG合成的氨基酸是甲酰化的甲硫氨酸，肽链中的AUG蛋合成的氨基酸是非甲酰化的甲硫氨酸。61蛋白质的合成可分为几个阶段：（1）氨基酸的活化（2）起始（3）延伸（4）肽链的终止和释放（5）新生肽的折叠和加工

Proteinsynthesis--------Mechanism2.2蛋白质合成的机制62（1）氨基酸的活化Proteinsynthesis--------Mechanism由氨酰-tRNA合成酶催化完成，反应在细胞质中进行631

IF1和IF3与30S亚基结合30S亚基与mRNA结合(16SRNA可以识别起始密码子前的SD序列)IF2与GTP结合，再与

30S亚基结合，形成一个复合物。4携带起始氨基酸的tRNA与上述复合物结合，同时将

IF3释放，由此形成30S起始复合物。（复合物中有那些成份？30S,mRNA,fMet-tRNAfMet,andIF1,IF2,GTP).50S亚基与30S起始复合物结合形成70S起始复合物。释放F1andIF2，水解GTP。Proteinsynthesis--------Mechanism（2）起始64IF1和IF3与30S亚基结合30S亚基与mRNA结合(16SRNA可以识别起始密码子前的SD序列)

IF2与GTP结合，再与

30S亚基结合，形成一个复合物。携带起始氨基酸的tRNA与上述复合物结合，同时将

IF3释放，由此形成30S起始复合物。Proteinsynthesis--------Mechanism6550S亚基与30S起始复合物结合形成70S起始复合物。释放F1andIF2，水解GTP。起始tRNA位于

P位点，

A位点是空的，等待下一个密码子。Proteinsynthesis--------Mechanism66Proteinsynthesis--------Mechanism核糖体上至少有3个与tRNA结合的位点：

Asitefor氨酰tRNA（aminoacyl-tRNA）

Psitefor肽酰tRNA（peptidyl-tRNA）

Esitefor卸载的tRNAs

离开核糖体67a氨酰tRNA的结合除了起始的氨基酸外,所有的携带氨基酸的tRNA必须与延长因子EF-Tu结合才能进入A位点.Proteinsynthesis--------MechanismTu和GTP结合,形成复合物,氨酰-tRNA与这个复合物结合,进入A位点,GTP水解,Tu-GDP离开70S核糖体.Tu-GDP经过与延长因子Ts和GTP结合而恢复成Tu-GTP,准备结合下一个氨酰-tRNA.（3）延伸68b肽键的形成A位和P位上的氨基酸之间形成肽键，P位上的tRNA卸载。A位上的tRNA上携带有一个2肽。催化反应的酶可能是23SrRNAProteinsynthesis--------Mechanism69c移位（translocation)需要转位因子EF-G和GTP.GTP水解,核糖体构象发生改变,加上EF-G的作用使核糖体向着3‘方向移动一个密码子(3nt)的距离.原来P为上空载的tRNA移到E位,离开核糖体,原来A位上携带2肽的tRNA移动到P位,A位空出。Proteinsynthesis--------Mechanism703个终止因子(释放因子):水解多肽链末段的肽-tRNA之间的键,将最后的tRNA和多肽链释放,将70S复合物解离成30S和50S亚基准备新一轮的合成.RF1识别UAG和UAARF2识别UGA和UAAProteinsynthesis--------Mechanism（4）肽链的终止和释放71（5）新生肽的折叠和加工（成熟）Proteinsynthesis--------Mechanism刚从核糖体上释放出来的多肽链是没有生物活性的，要经过“成熟加工”的过程才能具备有生物活性。详细内容将在后面讲述。

72Proteinsynthesis--------Mechanism蛋白质的翻译*蛋白质合成之起始*蛋白质合成之延伸*蛋白质合成之终止*观看蛋白质合成动画732.3原核细胞和真核细胞蛋白质合成的区别

Proteinsynthesis--------Mechanism真核生物和原核生物的蛋白质合成中发生的主要事件是一致的，只是内容方面有所差异。74真核细胞比原核细胞有更多的起始因子参与,起始复合物更复杂,寻找起始密码子的方式不同,起始氨基酸也不同。Proteinsynthesis--------Mechanism最大的区别在于合成过程的起始阶段

75真核细胞的翻译起始因子可以分为几类,有些与原核的IF1、IF2、IF3有相似的功能.与mRNA结合,识别5‘端的帽子，除去mRNA的二级结构Proteinsynthesis--------Mechanism与核糖体亚基结合eIF6,eIF3,eIF4C(相当于IF1和IF3)eIF4B,eIF4F,eIF4A,eIF4E76Proteinsynthesis--------Mechanism取代其他起始因子

如

eIF5与输送起始氨基酸有关如eIF2,eIF2B(相当于IF2)77Proteinsynthesis--------Mechanism真核细胞蛋白质合成起始从mRNA和游离的40S核糖体同时开始。40S核糖体40S-eIF3-eIF4CeIF3、eIF4C＋携带起始氨基酸的tRNAeIF2、GTP＋tRNA-eIF2-GTP40S-eIF3-eIF4C-起始tRNA-eIF2-GTP78Proteinsynthesis--------MechanismmRNA依靠5’末端的帽子结构eIF4F、eIF4BmRNA-eIF4F-eIF4B＋79Proteinsynthesis--------Mechanism比较－原核细胞的翻译起始事件的发生顺序80Proteinsynthesis--------MechanismmRNA-eIF4F-eIF4B40S-eIF3-eIF4C-起始tRNA-eIF2-GTP形成起始复合物，然后通过扫描找到mRNA上的起始密码子(密码子扫描)。81Proteinsynthesis--------Mechanism接着，起始因子eIF5

取代

eIF2

和

eIF3,并水解GTP

，60S亚基与复合物结合之后，eIF4C被释放，由此形成80S起始复合物，蛋白质的翻译起始结束。82Proteinsynthesis--------Mechanism原核细胞与真核细胞在其它方面的区别原核细胞真核细胞起始因子延伸因子终止因子IF1,IF2,IF3多个EF-Tu,EF-Ts,EF-GeEF-1α/eEF-1β/eEF-1γRF1/RF2/RF31个83Proteinsynthesis--------Mechanism原核细胞与真核细胞在其它方面的区别其它方面：核糖体大小、mRNA特点结构上差异（SD序列、尾巴、帽子、单或多顺反子结构）、起始氨基酸的差异等等。842.4蛋白质合成的抑制剂Proteinsynthesis--------Mechanism多种抗生素的作用机理就是阻止或妨碍蛋白质的合成。85某些抗生素对蛋白质合成的抑制位点作用阶段抑制剂作用对象作用机理(位点)起始链霉素细菌30S亚基的S12蛋白质春雷霉素细菌16SrRNA延伸黄色霉素细菌EF-Tu-GTP不能释放嘌呤霉素细菌氨酰tRNA类似物,进入A位,形成肽键,使多肽提前释放肽转移红霉素细菌,线粒体23SrRNA的修饰,抑制异位氯霉素细菌/线粒体50S蛋白质/23SrRNA移位放线菌酮真核细胞抑制80S移位酶,对70S无效梭链霉素细菌EFG-GDP不能释放硫链丝菌肽细菌抑制GTPase活性86Proteinsynthesis--------Mechanism除了抗生素外，还有一些药物的作用机制也是通过阻止蛋白质的合成而发挥作用的。这些药物称为“抗代谢药物”，如长春新碱、三尖杉酯碱、L-门冬酰胺酶等。87Proteinsynthesis--------Mechanism此外，白喉毒素和干扰素等也是通过干扰蛋白质合成而发挥作用的。白喉毒素(Diphtheriatoxin，Mr

58330)是一种修饰酶，可以使真核细胞的延伸因子2(e