TSDYYXH 02-2023 基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性快速评价方法

ICS11.120.01CCSC10SDYYXH团 体 标 准T/SDYYXH02—2023基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性快速评价方法Arapidmethodforevaluatingearlynephrotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel2023-12-28发布 2023-12-28实施山东省医药行业协会  发布T/SDYYXH02T/SDYYXH02—2023PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范围 3规范性引用文件 3术语和定义 3方法原理 4受试物 4仪器设备 4试验准备 4试验步骤 5保证试验有效性的条件 6判定标准 6数据处理 6试验报告 6附 录 A （资料性）斑马鱼典型图片 8前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省医药行业协会提出并归口。本文件主要起草单位：山东省科学院生物研究所。山东宏济堂制药集团股份有限公司T/SDYYXH02T/SDYYXH02—2023PAGEPAGE3基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性快速评价方法范围本文件适用于基于斑马鱼模型的药物早期肾脏毒性评价。规范性引用文件（）GB/T39649实验动物实验与质量控制GB/T21808化学品鱼类延长毒性14天试验GB5749生活饮用水卫生标准术语和定义下列术语和定义适用于本文件。斑马鱼 zebrafish模式动物的一种，常用于教学和科研。生物分类学上属于脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、斑马鱼属、斑马鱼种。AB系斑马鱼 ABstrainzebrafish实验室常用斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。仔鱼 larva性腺发育尚未成熟的斑马鱼。受精后小时数 hourspost-fertilization（hpf）斑马鱼胚胎体外受精后的小时数。眼周水肿 periocularedema斑马鱼双眼内部由于水分分布失衡，液体局部堆积使眼外围轮廓异常膨大。肌酐 creatinine肾小球尿蛋白 proteinuria尿液中的蛋白质含量增加而能够被检测到，反映肾脏滤过屏障功能情况。10 死度 10 letalcocenrato（L）受试物导致10%受试鱼死亡的浓度。15秒内没有心跳判定为死亡。荧光实时定量聚合酶链式反应 Real-timequantitativePCR（RT-qPCR）在DNA扩增反应中，应用荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。方法原理，72hpfnephrinkim1kim1受试物样品配制水溶性样品：斑马鱼培养水直接溶解配制成检测溶液。非水溶性样品：选用有机溶剂、乳化剂或分散剂等进行助溶，制备成均匀分散的悬浊液或乳浊液。受试物准备量10 mg～50 mg。30 mL～50 mL。受试物相关信息受试物的名称、来源、性状、批号、规格、生产日期、保存条件、有效期和配制方法。受试物为单体成分时，还需要提供该成分相应的化学信息，包括分子量、分子式、分子结构。提供受试物理化性质，包含如下信息：在水中或其它溶剂中的溶解性；在水中和光中的稳定性；温度对受试物稳定性的影响。仪器设备0.0001g。量筒。500mL0.5mL40RTqPR6孔半导体控温PR0.250～99.9℃。恒温光照培养箱。精度±1斑马鱼养殖系统。配备温控装置，水循环和过滤装置。水质监测设备。pH试验容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受试物可能吸附于聚苯乙烯容器时，应选用惰性材料（如玻璃）来减少吸附。低温高速离心机。配备致冷控温装置，转速≥5000rpm。蛋白凝胶电泳仪。配带垂直蛋白凝胶电泳槽。0.5mL～50mL。96试验准备受试斑马鱼72hpf健康ABGB/T39649斑马鱼培养水24h（GB57495mmol/LNaCl、0.17mmo/LKC0.4mmo/LCaC2和0.16mmo/LMgS。14625gNal0.64gKC2.20gCal2和1.72gMgS7HO1000mL5020mL的50980mL1pH6.58.以CaC3计为10mg/～250mgL6.0mg/。注：此培养水为斑马鱼提供最适生存水环境。试验溶液配制pH6.5～8.0pHpH6.58.0GB/T218086.3.2pH非水溶性受试物，添加有机溶剂、乳化剂或分散剂提高受试物溶解度和试验溶液的均匀度。受100mg/L。试验步骤试验分组试验设置空白对照组、阳性对照组和受试物组，如使用助溶剂，增设1个溶剂对照组。空白对照组设置AB24152mL斑，6505mL溶剂对照组设置AB24152mL助溶剂溶液，6孔板中每孔含50尾仔鱼和5mL助溶剂溶液。助溶剂溶液浓度为受试物组使用助溶剂的阳性对照组设置a2mMAB24152mL5µM马兜a，6505mL5µMa受试物组设置AB24152mL受6505mL暴露条件28.5124h。注：暴露期间禁止喂食。斑马鱼表型观察暴露结束，将仔鱼放置载玻片，调至俯卧位，显微镜下观察仔鱼眼部形态，采集图像。斑马鱼组织肌酐水平检测暴露结束后，收集仔鱼，加入适量体积0.9%NaCl溶液，冰浴下充分匀浆。离心后取上清，过柱去蛋白，按试剂盒步骤检测每组样品中肌酐含量。斑马鱼尿蛋白检测SDS基因检测RT-qPCR保证试验有效性的条件90水溶性受试物可配制成澄清溶液，非水溶性受试物可选用二甲基亚砜、乙醇、丙酮等有机溶剂进行助溶。斑马鱼图像采集时，各组间拍照参数一致。判定标准受试物组与空白对照组相比，斑马鱼组织肌酐水平在统计学上显著增加结果可作为受试物具有肾毒性的支持证据，但不替代人体功能检测。受试物组与空白对照组相比，斑马鱼肾病蛋白基因和肾损伤分子基因的表达量在统计学上显著增加数据处理统计分析方法：方差分析（ANOVA）T-test试验报告试验报告包含下列内容：受试物——物理属性、物理/化学特性；受试斑马鱼——学名、品系、来源、发育阶段、受精卵收集方法及后续处理；试验条件：光照周期；试验设计（试验容器及其平行的数目，每个平行中的仔鱼数量）；制备储备液的方法；若使用助溶剂，应给出其成分和浓度；斑马鱼培养水特性：pH试验容器内的水质：pH喂食情况。试验结果：斑马鱼头部照片（A1）；斑马