现代色谱分析课件

HPLC的介绍及应用一、HPLC的分离方式1、吸附色谱2、分配色谱3、离子交换色谱4、凝胶色谱1、吸附色谱

根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同而分离充填剂：硅胶2、分配色谱根据固定相与流动相的极性不同而分为正相分配色谱和反相分配色谱两者的区别如下图所示：

固定相流动相正相分配极性非极性反相分配非极性极性分配色谱

充填剂：多孔聚合物３、离子交换色谱

是根据固定相的离子交换基和样品成分中的离子性基进行交换来分离的4、凝胶色谱

凝胶色谱分离方法是利用分子振动效应，根据样品分子的大小而进行分离。所以又称为排斥色谱充填剂多采用：一定孔径的多孔性聚合物二、LC在环保方面的应用

1、农药残留量分析：含氯农药、有机磷农药、除虫菊2、致癌物质：霉素、亚硝胺(香烟中的亚硝胺)、苯并芘3、水质分析三、LC在生化方面的应用

1、蛋白质分析2、肽类的分析3、核酸4、氨基酸四、LC在药物方面的应用1、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等2、体液：血、尿、脊椎液、唾液等3、抗菌素：青霉素、甾族(激素)第二章色谱基本理论

第一节色谱图及基本参数

色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.色谱图示意图色谱图相关术语.

色谱峰(Peak):.峰底(PeakBase):.峰高h(PeakHeight):.峰(底)宽W(PeakWidth):.半(高)峰宽W1/2(PeakWidthatHalfHeight):.峰面积(PeakArea):.标准偏差(σ)(StandardError):.拖尾峰(TailingPeak):.前伸峰(LeadingPeak):.鬼峰,假峰(GhostPeak):色谱图相关术语.基线(Baseline):.基线飘移(BaselineDrift):.基线噪声(N)(BaselineNoise):.谱带扩展(BandBroadening):色谱图相关术语留值的基本参保数保留时间(tR)(Retentiontime):死时间(tM)(Deadtime):调整保留时间(tR’)tR’=tR-tM,校正保留时间（tR0）tR0=jtR,

净保留时间(tN)tN=jtR’,校正保留体积（VR0）:VR0=jVR净保留体积(VN):VN=jVR’

比保留体积(Vg):Vg=(273/Tc)(VN/ML)

保留值的基本参数有关分离的参数一相对保留值α又叫选择性系数或选择性因子α=1时两个组分分不开，改变α的途径是：改变固定相，改变流动相，改变样品本身的性质（如衍生化法）

二区域宽度

（1）标准偏差σ（2）半峰宽W1/2（3）峰底宽度W从色谱图中，可得许多信息：1色谱峰的个数，可判断所含组分的最少个数；2

根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；3

根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；4

色谱峰的保留值及其区域宽度，评价柱效依据；5

色谱峰两峰间的距离

三分配系数K与分配比(容量因子)K’:

1分配系数K

平衡状态时组分在固定相（CL）与流动相（CG）中的浓度之比。2分配比(容量因子)K’:

平衡状态时组分在固定相(P)与流动相(q)中的质量之比。

讨论：K’=0则tR=tM

组分无保留行为

K’=1则tR=2tMK’→∞tR很大组分峰出不来所以K’=1-5最好如何控制K’？主要选择合适的固定液色谱测K’容易（只测tRtM）所以常用K’四分配系数K与分配比K’的关系于

K=K’ββ=VG/VL=K/K’

五分配系数K,分配比K’与选择性因子的关系

t’R(x)---待测物X的调整保留时间t’R(z)---碳原子数为Z的正构烷烃的调整保留时间t’R(z+n)---碳原子数为z+n的正构烷烃的调整保留时间t’R(z)≤t’R(x)≤t’R(z+n)（通常n=1）规定正构烷烃的I值是其他原子数的100倍，如：正庚烷I=700保留指数I色谱柱效能的参数柱效：也叫柱效能。理论塔板数n有效理论塔板数neff理论塔板高度HH=L/n第二节气路系统一气体

H2N2Air

也可用CO2NeAr纯度要求大于99.99%

气体控制系统

检测器常用净化剂作用

TCD；FID变色硅胶：除H2O

TCD；FID分子筛：除H2O

FID；ECD活性碳：除有机物

FID；ECD脱氧剂：除O2

气体的压力与流量的测量

常用皂膜流量计，用时先将皂膜流量计管子内壁润湿

气体的纯化载气流量的校正

用皂膜流量计测得的流量F皂（mL/min)是在柱后大气压下测得的，欲将其换算成色谱条件下的流量FC需作三种校正：湿度校正;压力校正;温度校正1，湿度校正

2，压力校正PW---室温下的的水饱和蒸汽压P0---柱出口处压力Pi---柱入口处压力3，温度校正空心柱的载气流速通常不用皂膜流量计测量。而是由tM计算得到

载气的平均线速U=L/tM

例题“实验与习题”例4（P125）

作业：P131

41；42（思考）；43；

第三节色谱基本理论——塔板理论

GC是一种分离技术,组分先分离才可定性定量.如何选择最佳分离条件,这需要色谱理论的指导.塔板理论的假设1在理论板高H内，组分在气液相内快速平衡2载气以脉冲式进入色谱柱3无纵向扩散（柱向扩散）4分配系数K是常数

根据对色谱柱模拟蒸馏塔的假设条件，具体展开讨论组分在色谱柱中移动分配过程如下：

动画二、色谱流出曲线方程--基本关系式概率推导

设样品分子开始全部位于第0号塔板上，当色谱柱中通过N体积载气后，计算在第n块塔板上出现某组分分子的概率。这个概率应该是考虑在塔板上某组分的一个分子出现在流动相中的概率(Mp)等于在该塔板上流动相中组分分子的个数与整个塔板上组分分子个数之比。假设色谱柱由5块塔板组成：(0号板,1号,2号,…4号板)令N=5(N表示进入柱中载气的脉冲次数令组分进样量为：W=1

组分在柱内的分配过程是以气液色谱分配为例,组分在气液两相中进行分配○表示进入气相的组分分子□表示进入液相的组分分子此时若组分容量因子K，=1,即p=q

组分中有p量溶于液相组分中有q量溶于液相可用二项式准确表示出来(P+q)N组分在n=5,k,=1,w=1柱内任一板上分配表01234柱出口N=010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.250.3750.1250.063050.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1160.2750.2750.11880.0040.0320.0860.1960.2750.13890.0020.0180.0590.1410.2460.138100.0010.1010.0380.1000.1890.118得出色谱流出曲线方程：

三、塔板理论方程式的讨论

塔板理论成功之处较好地解析了色谱曲线形状2浓度极大点Cmax的位置是tR(即VR)3可用N评价柱效V=VR时流出曲线达浓度极大值Cmax

Cmax的影响因素

(1)

进样量W愈大,则Cmax愈大.W与Cmax成正比。这是色谱峰高定量的依据。（2）H值愈小，柱效愈高，Cmax/W比值愈大。即H越小，柱效N越高(3)色谱柱内径愈小，填充愈紧密，Cmax/W比值也愈大。即柱愈细填充愈紧密，柱效N越高。

（4）

色谱柱愈短，Cmax值愈大。（5）

先流出柱子的组分容量因子小，所以Cmax/W比值愈大，反之提高色谱柱的温度（对GC），增加流动相中强洗脱溶剂的浓度（对HPLC），都可以使容量因子下降，比而使Cmax/W比值愈大，提高色谱检测灵敏度。四、塔板理论的作用与不足

(一)塔扳理论在色谱法中的地位与作用：

1．从塔板理论方程式的形式看它描述的色谱信号轨迹应该是正态分布函数，与实际记录的色谱流出曲线相符合，说明此方程是准确的，且对色谱分配系统有理论指导意义。2．由塔板理论据导出来计算往效率的理论塔板数(N)公式，是行之有效的。长期以来用N值的大小评价色谱柱柱效是成功的，是色谱工作者不可缺少的计算公式。3.塔板理论方程式描述色谱峰极高点的Cmax数值是符合公式要求的，实验数据证明Cmax与N，W，VR之间的关系是正确的。各参数对Cmax之影响都是客观的。4．按塔板理论模型所建立起来的一些方程式讨论了某些色谱参数对组分色谱峰区域半峰宽公式均符台流出曲线半高峰宽变化的实际。特别应指出的是，塔板理论也提出了理论塔板高度对色谱峰区域宽度扩张的影响，这一点过去往往被忽视。(二)塔扳理论存在的不足：

1.塔板理论是模拟在一些假设条件下而提出的，假设同实际情况有差距，所以他描述的色谱分配过程定量关系合有不准确的地方。2.对于塔板高度H这个抽象的物理量究竟由哪些参变量决定的？H又将怎样影响色谱峰扩张等一些实质性的较深入的问题，塔板理论却不能回答。3.为什么流动相线速度(U)不同，柱效率(n)不同；而有时当U值由很小一下变得很大时，则柱效能（n）指标并未变化许多，但峰宽各异，这些现象塔板理论也无能为力．4.塔报理论忽略了组分分子在柱中塔板间的纵向扩散作用，特别当传质速率很快时，其纵向扩散作用为主导方面，这一关键问题并未阐述。5.塔板理论也未说明β变化对组分在柱内移动速率的影响。实际上VL、VG在某些方面决定着组分分子的扩散行为和扩散距离。综上所述塔板理论虽为半经验理论，但在色谱学发展中起到了率先作用和对实际工作的指导作用，所以至今延用不衰，为广大色谱工作者承认。

塔板理论不足之处

不能解析载气流速U对N影响

不能指出板高H受那些因素影响第四节色谱理论--速率理论基于无规行走模型，定义H为单位柱长的离散度H=σ2/L,式中σ为高斯峰形的标准偏差，L为柱长。并假设：①纵向扩散是造成谱带展宽的重要原因，必须予以考虑；②传质阻力是造成谱带展宽的主要原因，它使平衡成为不可能③对填充柱有涡流扩散的影响

vanDeemter方程的数学式为H=A+B/U+CU或H=A+B/U+CsU+CmUA、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。速率理论讨论1、涡流扩散项A=2λdγλ为反应柱填充状态的常数

dp为填料垃径2、分子扩散项B/u（纵向扩散项）

B=2K0Dg

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为

K0为阻滞常数即弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中扩散系数(cm2.s-1)色谱柱中的涡流扩散示意图

色谱柱中的涡流扩散示意图

色谱柱中的涡流扩散示意图

3、传质阻力项CU=(Cg+CL)U

传质过程分为：气相传质过程与液相传质过程传质阻力系数C等于气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数CL之和：

（1）气液色谱C=Cg+CL

气相传质阻力系数Cg为：液相传质阻力系数

CL：

范氏方程

H=A+B/U+CsU+CmU

令C=Cs+Cm

则H=A+B/U+CU

作H~U图(见下页):方程讨论

讨论1.曲线有一最低点Uopt(即Hmin)

将方程微分:2.对开管柱(毛细柱)A=0

得Golay方程H=B/U+CU

对填充柱A项与U无关,决定与柱的填充情况3.U很小时:CU项可忽略,方程简化为:

H=A+B/U

作H~1/U直线,斜率为B4.U很大时:B/U项可忽略,方程简化为:

H=A+CU

作H~U直线,斜率为C,截距A5.K/对板高H的影响(比较复杂):

N随K/的变化而变化综合考虑:U实际稍高于Uopt

因为:1.右侧曲线斜率小,U稍变不会引起H的大变化2.为提高分析速度因为U↑则tR

↓

第五节分离条件的优化要求1.两峰间有一定距离—tR不同要求2.峰宽要窄—W1/2要小提问:怎样制备一根好的色谱柱?怎样评价?怎样选色谱条件?一般:1.选择性(相对保留值α或保留指数I)－－评价固定液对物质的保留作用2.柱效能(n.neff)－－评价柱分离效能3.分离度R(总分离效能指数)分离度是将以上二者综合考虑既反映柱效能,又反映选择性

一.分离参数1.n与neff的关系可见neffn都随K/变化而变化因为K/不同，柱效不同,所以评价柱效应采用K/为一定值时的nW1/2与tR的关系--半峰宽规律

W1/2=a+btR实验研究表明:同系物组分的半峰宽线形关系好非同系物组分的半峰宽线形关系差所以我们称之为准线形关系.

半峰宽规律的应用

有两种情况

1第二个峰可能不只一个组分

2也许是第一针留下来未出峰的组分

选择性系数(相对保留指数)可见二组分沸点差大,柱温低时,αis

大,易分离.分离度分离条件的选择主要是提高“难分离物质对”的分离度（1）峰宽分离度R国家标准分离度

当两峰高相差不大,且峰型接近时可以认为W1=W2=W

(2)半峰宽分离度R1/2

R与R1/2关系,对于高斯R1/2=1.7R二，分离基本关系式此式用于计算达到一定R时所需的n必须

n表示柱效,难以说明真实分离效果α1.2表示选择性,表示固定液对组分保留作用,不说明柱效R是总分离效能指标,只有>1时,二组分才有可能分离α1.2讨论：

R=1

分离程度达98%

R>=1.5

完全分离,达>=99.7

也叫基线分离

R<1

二峰明显重叠分离度与柱效关系(R与n)所以我们希望用柱效高的色谱柱2.R与K，的关系

α1.2由上式可知：(1)增加塔板数可以提高分离度(2)k值的最佳范围是：1＜k＜10(3)相对保留值α增大，能显著地提高分离度两根同种色谱柱的相互关系式：例如:柱长L=30cm分离度R=1.06

柱效n=3490分析时间tR2=17.63min;要使分离度达到R=1.5或以上,就需要改变L,n如果换一根30cm长,但n=7000的柱则tR2=17.63min内可达R=1.5的分离度若采取加长色谱柱的方法,则需要60cm,

分析时间tR2=35min死体积(VM)(Deadvolume):VM=tMFcFc为色谱柱内载气平均流量。保留体积(VR)(Retentionvolume):VM=tRFc，调整保留体积(VR’)VR’=tR’Fc=VR–VM,保留值的基本参数3.分离度R与保留时间tR的关系说明:缩短分析时间的最有效的措施是提高柱效缩短柱长,增加载气流速也可以提高分析速度但前提是保证足够的R值三、分离条件的优化改变n和Hn=L/HLn但分析时间也增加最好是在不增加柱长的条件下,减少H,以达到增加n根据范氏方程选择操作条件,使H(1).Uopt

选U实稍高于Uopt,一般30ml/min∵右侧平坦U稍变化不会引起H大的变化

U大使tR小,分析速度加快B/UCU(2).固定液及配比降低Cs项(液相阻力),dl(膜厚)要小即配比要低

dl太小有两个缺点:

a.进样量小(肚子小)

b.载体表面被固定液覆盖小,使载体出现极性,因吸附作用会产生拖尾峰(3).载体粒径影响A项Cm项要求惰性,颗粒小而均匀一般80~100目筛分范围窄好(4).采用小内径的色谱柱柱径4mmHUH柱径2.2mmU20~30目40~50目100~150目2.改变k如图k>5,R变化就很小了GC分析:最好k=2~5

一般不超过10否则大大延长分析时间如何改变ka.降低柱温Tc,使k上升

b.降低流速U,使k上升RtR246kk对R,tR的影响3.改变

α1.2

R1.2是准热力学常数,在流动相,固定相一定时,只与Tc相关当α1.2=1时,改变H,k

都无法使1和2两个组分分离∴应当保持k=2~10的前提下,设法改变α1.2

方法是:a.改变柱温Tcb.更换色谱柱

c.衍生化法(即利用化学反应改变待测物结构)4.程序升温程序升温可使待测物在适当温度下流出,以保证每个组分有合适的K/值,同时改变分离度程序升温是分离复杂多组分沸程宽的混合物的有效方法5.进样

δi<0.204δδi进样峰标准偏差

δ实际峰标准偏差进样快防止纵向扩散进样量小使峰对称,一般进样0.1~10μl

固定液含量低时(毛细柱)进样量要少进样技术之优劣,可以从空气峰,甲烷峰形宽度反映出来柱温Tc如何选择?最佳柱温:最难分离物质对所需柱温恒温Tc低

Tc高如何选Tc恒温分析:柱温大概是等于样品沸点的平均温度

如有两个组分混合样,沸点为70°C,90°C

则选Tc=80°C

汽化室温度要高于80°C,高20~50°C

检测器温度要高于80°C,高20~50°C

程序升温用与:多组分,宽沸程样品的毛细柱分析,一般配FID综上所述:GC的分离优化就是要在保证分离度和灵敏度的条件下实现快速分析实际:提高分离度,往往牺牲分析速度提高灵敏度,有时要制备分离样品就降低分离效率

一般:先满足分离度要求,再提高分析灵敏度,最后考虑缩短时间.分离度灵敏度分析速度GC测验题已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数；（3）达到1.5分离度所需的柱长度。解（1）柱的分离度R=2（17.63-16.40）/（1.11+1.21）=1.06（2）柱的平均塔板数n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2

=3397

n平均=（3493+3397）/2=3445（3）达到1.5分离度所需的柱长度

R1/R2=(n1/n2)1/2

n2=3445(1.5/1.06)2=6898L=nH=6898

(300/3445)=60cm

高效液相色谱实验技术

一、色谱柱的保养

二、色谱柱的再生

三、实验前准备工作

四、样品处理技术

色谱柱的保养

在正常情况下，色谱柱至少可以使用3—6个月，能完成数百次以上的分离。但是，若操作不慎，将使色谱柱很易损坏而不能使用。因此为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须对色谱柱进行仔细地保养。

1、色谱柱极易被微小的颗粒杂质培塞，使操作压力速升高而无法使用，因此必须将流动相仔细地蒸馏或用0.45μm孔径的滤膜过滤。在流动相组贮槽与色谱柱间，安装0.45μm孔径的过滤器。在柱子上端接头处装上多孔过滤片，以防止固体颗粒进入色谱柱中。在水溶液流动相中，细菌容易生长，可能堵塞筛板加入0.01％NoHa能防止能防止细菌生长。2、最好使用进祥阀进样，以防止注射器进样时、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。

3、对硅胶基键合相填科，水溶液流动相的PH值不得超出2—8．5的范围，使温度不宜过高。柱子在酸性或碱性条件下使用之后，。应依次用水、甲醇清洗，对暂时不用而需要较长时间保存的柱子，要用纯甲清洗，柱子两端用金属螺帽封闭，保存于干净的有机溶剂中。

4、要防止色谱柱被振动或撞击，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。

5、要防止流动相逆向流动，否则将使固定相层位移，柱效下降。

6、使用保护柱。连续注射含有未被洗脱样品时，会使柱效下降，保留值改变。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱间加上保护柱，其长度一般为3—5cm，填充与分析柱性质相似的表面多孔型固定相，因此可干法填装。而且价廉、更换容易。实验表明，使用保护柱后，除了使扩为零的组分的塔板数减少外，其柱效下降很少。色谱柱的再生

一般情况下，硅胶和ODS等化学键合固定相再生是困难的。有时，采用下述方法可能提高校效。

1、由于杂质微粒等因素，使柱上端固定相变色，柱效下降。这时，可仔细地将变色部分除去(约3mm左右)，再补充新的固定香。

2、当色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，可选择合适的溶剂进行洗净。

3、对离子交换树脂柱，先经1mol／LHCI相1molNaOH溶液洗净，再以1—2mol/LNaCl水溶液平衡，以超声波发生器进行清洗，通常可获良好的效果。4、当采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。实验前准备工作

1．流动相溶剂的处理

2．试样溶液的制备

流动相溶剂的处理

(1)水

将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH9—10的条件蒸馏，可用于常规洗脱。用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸馏。

(2)有机溶剂的提纯通常用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。将溶剂通过氧化铝或硅胶柱可除去极性化合物。氯仿中含有的少量甲醇，可先经水洗再经蒸馏提纯。试剂级的四氢呋喃由于含抗氧剂丁基甲苯酚而强烈吸收紫外线，可经蒸馏除去难挥发的丁基甲苯酚。为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。(3)溶剂的过滤和脱气

流动相溶剂在使用前必须先用0.45ym孔径的滤膜过滤，以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞。同时要进行脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正常操作的进行。

样品处理技术

在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。它们的存在，将影响组分的分离测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降低，所以常需对试样预处理。样品的预处理方法很多，如溶剂萃取、吸附、超速离心及超过滤等。

1．溶剂萃取溶剂萃取适用于待测组件为非极性物质。在试样中加入缓冲溶液调节pH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但如果待测组分和蛋白质结合，在大多数情况下；难以用萃取操作来进行分离。2．吸附

将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱内进行吸附。亲水性物质用硅胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯—二乙烯基苯等类树脂吸附。

3．除蛋白质

向试样中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白质被沉淀下来，然后经超速离心，吸取上层清液供分离测定用。

4．超过滤

用孔径为l0×10-10一500×l0-10m的多孔膜过滤，可除去蛋白质等高分子物质。

HPLC的介绍及应用一、HPLC的分离方式1、吸附色谱2、分配色谱3、离子交换色谱4、凝胶色谱1、吸附色谱

根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同而分离充填剂：硅胶2、分配色谱根据固定相与流动相的极性不同而分为正相分配色谱和反相分配色谱两者的区别如下图所示：

固定相流动相正相分配极性非极性反相分配非极性极性分配色谱

充填剂：多孔聚合物３、离子交换色谱

是根据固定相的离子交换基和样品成分中的离子性基进行交换来分离的4、凝胶色谱

凝胶色谱分离方法是利用分子振动效应，根据样品分子的大小而进行分离。所以又称为排斥色谱充填剂多采用：一定孔径的多孔性聚合物二、LC在环保方面的应用

1、农药残留量分析：含氯农药、有机磷农药、除虫菊2、致癌物质：霉素、亚硝胺(香烟中的亚硝胺)、苯并芘3、水质分析三、LC在生化方面的应用

1、蛋白质分析2、肽类的分析3、核酸4、氨基酸四、LC在药物方面的应用1、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等2、体液：血、尿、脊椎液、唾液等3、抗菌素：青霉素、甾族(激素)第六章

毛细管柱气相色谱法

高分辨率气相色谱仪

毛细管色谱柱的种类及特性

毛细管色谱柱的操作条件

进样系统的特性

最近毛细管气相色谱的分析例

第一节

高分辨率毛细管气相色谱仪的三要素

选择好的毛细管柱及最佳分析条件

按样品选择合适的毛细管进样系统

选择高性能的毛细管气相色谱仪

第二节GC用色谱柱的种类及特点

色谱柱的种类１、GC用色谱柱的种类。

２、熔融石英玻璃毛细管种类。

柱色谱柱的特点

１、毛细管柱色谱柱的特点

２、宽口径毛细管柱的特点

GC用色谱柱的种类：

a．填充柱长度0.5-5m(多用2m的)外径2-4mm填料5%-10%的液相(硅藻土担体)液相

种类多，理论塔板数不太高，根据需要进行选择

b．毛细管柱长度10、25m（有时50m）内径0.1，0.22，0.32mm材质

熔融石英玻璃(惰性、弹性)液相种类少

CBP-1,5,10,20

理论塔板数高(10万以上),液相的种类不是太重要

熔融石英玻璃毛细管种类：

a．毛细管柱长度10、25m（有时50m）内径0.1，0.22，0.32mm材质

熔融石英玻璃(惰性、弹性)液相

种类少

CBP-1,5,10,20理论塔板数高(1万以上)，

液相的种类不是太重要b．宽口径毛细管柱柱长12-50m内径0.53(0.75mm)液相

种类少

理论塔板数高

液相选择不太重要液相膜厚1.0-5.0μm适于大样品量故需厚一些

宽口径毛细管柱的特点：大口径毛细管柱液相膜厚--比毛细柱分离差，比填充分离好--进样量大于毛细管柱，小于填充柱容易使用－－直接进样不需分流／无分流和尾吹气体柱内壁比填充柱惰性好分析时间比填充柱短，峰形更对称毛细管柱色谱柱的特点：

自加工困难，需购买成品柱高分辨率（理论塔板数10万以上）省时和高分离任选

省时－－短柱，高流速

高分离－－长柱、膜薄、适当的流量3种类型WCOT，SCOT，PLOT适于复杂样品的分析（30个峰以上）第三节

毛细管色谱柱的操作条件

毛细管柱使用的固定液(GLC)毛细管柱内径、长度、膜厚与分离、进样量、时间的关系

毛细管柱比较毛细管柱的连接不好时毛细管ＧＣ的最佳分析条件毛细管色谱柱的维护方法

毛细管柱使用的固定液(GLC)牌号固定液极性对应名称最高使用温度CBP1聚甲基硅氧烷非极性OV-1，SE-30320℃CBP55%聚苯基甲基硅氧烷弱极性SE-52，54320℃CBP10氰基硅油中极性OV1701240℃CBP20聚乙二醇强极性PEG-20250℃

毛细管柱内径、长度、膜厚与分离、进样量、时间的关系毛细管柱比较()内表示最高使用温度（℃）液相种类岛津J＆WSupelcoOV-1SE-30CBP1(320)CBP1(450)DB-1(350)SPB-1(320)SE-52SE-54GBP5(320)DB-5(350)SPB-5(320)OV1701CBP10(270)DB-1701(320)SPB-350(300)PEG20MCBP20(240)DBWAX(260)SUPELCOWAX-10(280)毛细管柱的连接不好时溶剂峰拖尾，很异常

Ａ组分产生拖尾，峰扩展

毛细管ＧＣ的最佳分析条件载气

进样方式

色谱柱

柱温

检测器

毛细管色谱柱的维护方法

---除掉柱内残留的难挥发组分

老化柱子

剂清洗

除掉柱入口污染的部分

第四节进

样

系

统

无分流进样法（Grob式）

歧视效应

溶剂效应

冷柱头进样法

快速升温（PTV）分流进样

１．2．分流进样：分流比：1∶10～1∶500＝毛细柱常用分流比1∶30～1∶120无分流进样法（Grob式）

岛津Grob式分流/无分流进样装置SPL-G9结构图3．Grob不分流进样：进样时把分流阀关掉1分钟，柱温低于溶剂沸点，进样后再打开分流阀、升温。4．溶剂效应：起始柱温低于溶剂沸点20～40℃，使样品凝结于铸铁，溶剂对溶质暂起着固定液作用，使被气化了的试样蒸汽在柱入口凝结成液体，起聚焦作用。溶剂效应使低沸点成分停滞，使样品在柱入口浓缩，使峰锐化。４．冷柱头进样法

把样品直接注入低温毛细柱顶端，然后使柱升温、气化的方法。岛津冷柱头进样器OCI-G9操作：①

载气流量0.5-3ml/min冷却-加热器柱温25-45℃②

先开入口样品注入大口径毛细柱入口后闭入口阀.③

冷却-加热器柱炉同时程序升温100℃/min④

用专用超细针头.

岛津冷柱头进样器OCI-G9

冷柱头进样法

优点：1．利用分析热不稳定物质(可抑制分解和异构化)。2．

不存在组分的区别对待问题(失真少、重现好、准确)。缺点：1．难挥发组分会污染柱子

2．高浓度组分要稀释后分析。

解决方法：

1．

保留区间（在分析柱前连接一根无液相涂层的空柱子）的利用

2．

PTV（快速升温气化）的利用歧视效应：

注入色谱柱的组分比率与样品组分不同。通常，进柱内低沸点的组分多，高沸点的少一些。

解决方法

1.

溶剂冲洗进样法2.

冷柱头进样法3.PTV（快速升温气化）法

快速升温（PTV）分流进样

PTV法歧视效应小程序升温

分流进样

用各种内径的柱子

最近毛细管气相色谱的分析例(农残分析)

第七章程序升温气相色谱法

第一节方法概述

1．方法特点：适用对象：多组分、沸点范围宽的样品。溶剂效应：气捕集技术。

2．程序升温方式：

单阶程序升温多阶程序升温３．程序升温与恒温气相色谱法的比较：

IGC与PTGC的比较参数LGCPTGC样品沸点范围

＜100％100％－400％进样量＜1－5μl≤10μl进样速度对第一个色谱峰，进样时间应小于0.05Wh/2(半峰宽)

进样方式直接进样分流进样柱上进样直接进样,分流－不分流进样,柱上进样,多维柱切换进样,顶空和裂解器进样载气纯度无严格要求需高纯载气峰容量≤10个组分＞10个组分固定相选择可广泛选用固定相只能选用耐高温、低流失固定相对色谱峰的检测对保留时间长的组分检测较不灵敏随温度速率增加,可改进对保留时间长的高沸点组分的检测灵敏度载气流速控制方式恒压恒流(使用稳流阀)分析速度慢快

第二节基本原理

保留时间初期冻结有效柱温程序升温的操作参数第三节操作条件的选择

1．操作条件的选择升温方式起始温度终止温度升温速率载气流速柱长：２．对程序升温的要求

载气的纯化和控制耐高温固定液的使用

SE－30（350℃）、OV－101（350℃）、ApiezonL（300℃）、OV－17（300℃）、PEG－20M（250℃）３．气相色谱法的应用范围：多组分宽沸程样品的分离：香料、酒类等。恒量分析第三章色谱的定性和定量分析色谱法分离好,定性难色谱分析分三个阶段仪器调试操作条件选择定性定量---保留值定性---峰高,峰面积定量第一节定性一.保留值定性1.利用纯物质对照定性优点：简单缺点：要有纯样，适用于已知物，操作条件要稳定2.相对保留值定性优点：比绝对法重现性好缺点：也需要纯样，比绝对法麻烦3.加入已知物增加峰高法

在未知样品加入纯样看哪个峰高增加的组分即可能为这种已知物。4.保留指数定性法IiX=100[Z+（lgt

R(i)-lgt

R(Z)）/（lgt

R(Z+1)-lgt

R(Z)）

优点：测得Ix值与文献值对照就可定性。缺点：1.要有正构烷烃纯样。2.可供查阅的文献值太少。3．柱子与柱温要与文献规定相同二其它方法定性1.用比保留体积Vg定性

优点：不用纯样缺点：如果固定液流失，则定性不准。2.利用保留值规律定性

a.碳数规律logVg=A1n+B1b.沸点规律logVg=A2Tb+B2c.柱温规律I=A3+B3三.选择检测器定性

四.联用GC-MSGC-FTIR(傅立叶变换红外光谱)GC-NMR缺点：标准谱图太少，一般用计算机检索五．双柱定性：一根极性柱，一根非极性柱。对于一根柱子上有相同保留值的组分可采用双柱定性。若二根柱上tR未知与tR已知都吻合，则定性可靠性就增一倍。

第二节定量

1.求峰面积定量准确度决定于2.求相对校正因子

3.选准确定量方法一.峰面积1.对称峰：A=1.065W1/2h2．不对称峰

A=1/2

h（W0.15+W0.85）

式中W0.15和

W0.85

分别为峰高0.15倍和0.85倍处的峰宽

二.定量校正因子f为什么要用f？∵不同组分有不同的响应值例如用TCD，N2作载气测O2，H2的百分含量若H2、O2峰面积相同,百分含量相同就不对。不能用下式计算：

∵H2的热导系数大,TCD响应大,但实际含量小∴必须用校正因子.

ACfH250050%0.1O25050%1

绝对校正因子f叫绝对校正因子,决定于检测器的灵敏度，f不易测定。∴常用相对校正因子f’

通常所指的校正因子都是指相对校正因子。1.

相对校正因子相对校正因子定义为即某组分i的相对校正因子f’为组分i与标准物质s的绝对校正因子之比。

2.相对校正因子的表示方法

重量校正因子与摩尔校正因子

重量校正因子w--重量A--峰面积摩尔校正因子M--分子量

准确定量分析时,应该用自己测定的校正因子,而不用文献值∵校正因子随检测器类别,使用载气的不同而不同3.相对校正因子的测定方法

f’值可引用文献值，也可以自己测定。标准物质，TCD是苯，FID是正庚烷。准确称量被测组分wi和标准组分ws的重量在线线范围内进样测Ai,As

求f’

w或f’

M

多次测定，求平均值。三.定量方法归一法,内标法,外标法。各有其优缺点,

1归一法优点:是相对法∴与进样量无关,定量较准确缺点:要求全出峰(样品所有组分都要出峰)

全知峰(有所有组分的标准品)

……2.外标法(标准曲线法)用待测组分的纯样制标准曲线优点：快速简单,只要待测组分出峰且完全分离即可缺点：绝对法,进样量,操作条件要不变

3.内标法(外加标准法)不能全出峰或只需测某几个组分时采用方法:准确称取样品,加入一定量内标物,根据重量及峰面积求出某组分的含量Ws

内标物重量As

内标物峰面积Ai

被测物峰面积fs

内标物重量校正因子fi

被测物重量校正因子W样品重一般选内标物为基准，fs=1步骤:a.选内标物

b.测fw(i/s)(fi)c.称未知样W.内标物Ws,测Ai,As内标法的关键是选择合适的内标物，它必须符合下列条件：(1)是样品中原来不存在的纯物质，性质与被测物相近，能完全溶解于样品并且不与样品发生化学反应。（2）内标物的峰应尽量靠近被测组分的峰，或位于几个被测物之峰的中间并与这些色谱峰完全分离。（3）内标物的质量应与被测物质的质量接近，能保持色谱峰大小差不多。例:测甲苯,乙苯,正丙苯的混合物,苯作内标物求组分含量组分面积cm2

校正因子fw(i/s)苯4.001.00甲苯3.840.96乙苯1.950.92正丙苯0.820.90内标法优点:是相对法,不要求全出峰,全知峰缺点:要有内标物纯样,两次称重,比较麻烦Ws/W=1/10总结:归一法与内标法：是相对法，与操作条件无关，误差小外标法:简单，是绝对法，与操作条件有关作业：P1471718第四章色谱仪及检测器

第一节色谱仪

---五大系统组成：

1.气路系统

2.进样系统（1）进样器

（2）气化室

3.分离系统--填充柱和毛细管柱。

4.控温系统

5.检测和记录系统

第二节检测器性能及评价

色谱柱是色谱仪的心脏，而检测器就是眼睛，无论分离效果多么好，若没有好的检测器就看不到结果。

TCDFIDECDFPD类型浓度型通用型质量型准通用型质量型选择型浓度型选择型最低检测限度丙烷<400pg/s丙烷<5pg/s六氯苯<0.04pg/s硫20pg/s磷0.9pg/s线形范围105107>104硫>105磷>106适用范围永久气体有机物有机化合物电负性化合物含硫磷氮化合物常用检测器主要性能检测器性能检测器的性能指标浓度型Det:TCD;ECD响应值R与载气中组分浓度C成正比R∝C质量型Det:FID;FPD响应值R与单位时间内进入Det中的某组分质量成正比R∝dm/dtC一.灵敏度-----指信号随组分的浓度(或质量)的变化率S=△R/△m(1)浓度型Det

∵R∝CC--浓度∞信号RR=ScCSc--灵敏度

R--响应值灵敏度公式推导:m=∫0∞cdv

m进样量(进入Det的某组分的量)C进入Det中某组分浓度mg/mlV进入Det中的载气体积ml

记录仪上信号X记录纸移动距离Xcmh流出曲线高度cm设u1--记录仪灵敏度mv/cmu1=满标量程5mv/满标纸宽25cmu2--纸速cm/min载气流量Fd=V/tV--进入det的载气体积

t--所需要的时间

∴V=Fdt=Fd.x/u2dV=FddX/

u2

Sc的单位:液样mv.mL/mg

每mL载气中有1mg试样时在det中产生讯号的mv数气样mv/ml/ml讨论1.条件一定时,Det的Sc是一定的流速Fd一定时,此为定量依据2.m一定时,对浓度型Det,用A定量时一定要保持流速恒定用峰高定量较好(2)质量型Det∵t以秒为单位纸速u2以分为单位∴要乘60mv/g/sec讨论:St一定A∝m此为定量依据

m一定峰面积与流速无关用峰面积定量较好注:对于给定仪器,灵敏度值还与测定条件,样品有关二.噪音N,漂移M,检测限D是否灵敏度放大到越高越好?检测限D(也叫敏感度)定义:为检测器二倍噪声的水平噪音N,漂移MS↑N↓D越小越敏感因此性能好的Det,不但灵敏度高而且噪声要小组分在Det中的信号必须大于Det本底信号(噪声)才能与噪声区别，规定:组分信号至少为噪声的二倍,才可定量。三.最小检测量定义:产生色谱峰高等于二倍噪声(2N)时的进样量

∵进样量为m时,洗出峰高为h,记录仪灵敏度u1(1)对浓度型Det(2)对质量型Det

四.最小检测浓度

指一定进样量m时,GC分析所能检测出的最低浓度V--进样体积五.线形范围R∝C

定义:信号与进样量成正比的数量范围即最大允许进样量与最小允许进样量之比

线形范围宽:

表示不管是含量高的组分或是微量组分都能准确定量△R△m第三节热导检测器(TCD)1.结构R1R2R3R4是阻值相等的热敏电阻组成惠斯登电桥2.原理:

当参比池与测量池都只有一定流量的载气通过时,电桥平衡(R1R4=R2R3),无信号输出(0mv,走基线)

当样品组分+载气通过测量池时,由于组分与载气的导热系数不同,使热敏元件的电阻值和温度发生变化,电桥失去平衡(R1R4=R2R3),AB两端产生电位差,有信号输出,且信号与组分浓度成正比.

不同物质具有不同的导热系数100°C时

H2AirCCl4N2He单位

22.403.140.923.1417.4110-4J/cms°C3.工作条件(1)载气性质载气与被测组分导热系数相差愈大灵敏度愈高∵λH2及λHe>>λN2∴最好用H2He作载气(2)桥电流R∝I3

要注意桥流,池体温度,载气种类三者之间的关系桥流太大钨丝易烧坏

N2作载气,

110~150mAH2作载气,

150~250mA(3)池体温度低,灵敏度高但池温必须高于柱温,否则组分会在池体内冷凝信号丁烷浓度HeH2N2流速桥电流mA200100HeH2ArN2HeH2N2HeH2ArN24.TCD使用注意事项(1)为确保热丝不被烧断,在TCD通电前,先开载气关机时一定要先关电源,后关载气(否则检测器会报废)(2)载气中含氧气时,使热丝寿命缩短

∴载气必须除氧,而且不要使用聚四氟乙烯作载气输送管∵它会渗透氧气5.TCD性能与应用(1)属浓度型Det,进样量一定时峰面积A∝1/Fd∴用A定量时要保持流速恒定(2)属通用型Det,可测多种类型组分特别是可测FID所不能直接测定的许多无机气体(3)是非破坏型Det∴利用样品收集或与其他仪器联用第四节氢火焰离子化检测器(FID)1.结构主要是离子室离子室包括:气体入口喷嘴收集极(+)

极化极(-)2.原理

H2+O2燃烧产生2100°C高温，

使被测有机组分电离

∵收集极(+)与极化极(-)间加有恒电压，形成一个静电场，所电离的离子，在电场作用下形成离子电流，通过高阻取出讯号，经放大记录下来。3.工作条件

a.仪器接地好,屏蔽良好b.TDet>120°C,使离子室不积水,TDet要高于Tc20~50°Cc.一般用N2作载气,载气要净化,除有机物d.气体流量H2:N2:Air=1:1:10

4.特点

a.属质量型,A与Fd无关属破坏型∴不能制备联用b.适用水和大气中痕量有机物，对烃类灵敏度高，比TCD高102~104倍

FID不能检测在H2焰中不电离的CO2COH2OH2SCS2N2NH3等无机物(即水与永久气体等)第五节其他检测器一.ECD1.结构2.原理:

Ni63放射源放射出β射线与载气N2碰撞产生电子,这些电子在电场作用下向收集极移动,形成恒定的基流,当载气中有电负性组分捕获这些低能量的电子,使基流降低,产生倒色谱峰讯号高纯N2载气N2N2++e样品组分AB+eAB-+EAB-+N2+AB+N2β射线3.工作条件:(1)载气纯度,用高纯N2(99.999%)含O2<10PPm

若用普通N2(含O2100PPm)则必须净化除氧,水等

∵O2是电负性物质,可使基流降低很多载气流量40~100ml/min(2)极化电压:在50mv以内,通常20~50V∵极化电压过高使电子能量过大,不易被组分捕获

∴不能直接供电,而用脉冲供电,使电子能量较小,易捕获

∴灵敏度提高4.特点(1)是选择性Det,对卤素及S,P,O,N等化合物响应大对烃类无响应，对CCl4响应值比正己烷大108倍

∴可与FID组合定性(2)灵敏度高,最低检测限度很低但线形范围窄,约104(3)浓度型Det,峰高定量为宜二FPD火焰光度检测器也叫硫磷Det1.结构:由氢火焰和光度计二部分组成2.原理:

含S,P化合物在富氢焰中燃烧产生激发态S2*或发光HPO*

同时发射出不同波长的特征光谱

S2*的特征光谱为394nmHPO*的特征光谱为526nm此光谱经干涉滤光片选择,将特定波长光输入倍增管产生光电流,放大后记录3.工作条件:

富氢,H2流量150~160ml/minN2流量40~50ml/min4.特点:质量型Det用于测含S,P化合物,信号比C-H化合物大10000倍用P滤光片时,P的响应值/S的响应值>20

用S滤光片时,S的响应值/P的响应值>10

第五章填充柱气相色谱

因为Gc的载气种类少，分离选择性主要靠选择固定相，峰能否分开，首先取决于固定相，迄今已有数百种GC固定相，常用的不过十几种。固定相：

1.固体固定相GSC如吸附剂

2.液体固定相GLC

固定液涂在载体表面第一节固体固定相吸附剂、高分子多孔小球、化学键合相、1.常用吸附剂

活性炭---非极性分析:永久气体，低沸点烃类氧化铝---中等极性C1—C4

烃类硅胶----强极性C1—C4

烃类H2SN2OSO2

分子筛---特殊吸附性永久气体H2,O2,CH4.CO等特点：能在高温下使用；很难制备重复性好的吸附剂;峰往往拖尾。

二、高分子多孔小球（即多孔聚合物）（1）非极性的是由苯乙烯、二乙烯苯共聚而成。（2）极性的是苯乙烯、二乙烯苯共聚物中引入极性基团。

高分子多孔微球的特点：（1）表面积大，机械强度好（2）疏水性，可快速测微量水分（3）耐腐性，可分析HCI、NH3、HCN、CI2

SO2等活性气体（4）不存在固定液流失问题三、化学键合相

优点：防止固定液流失，提高柱效第二节液体固定相一、特点1、可得较对称的色谱峰2、可供选择的固定液很多3、谱图重现性好4、可在一定范围内调节液膜厚度二、对固定液的要求1、热稳定（每种固定液有“最高使用温度）2、化学稳定性好3、粘度适当和凝固点低，凝固点就是“最低使用温度”4、对组分有一定的溶解度，即组分有一定的滞留性

三、固定液与组份分子间作用力定向力、诱导力、色散力、氢键作用力。