SN 1675-2005鱼真鲷虹彩病毒聚合酶链反应操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准鱼真鲷虹彩病毒聚合酶链反应操作规程Protocolofpolymerasechainreaction(PCR)forredsea-breamiridovirus(RSIV)offish2005-09-30发布国家质量监督检验检疫总局I本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。11范围2规范性引用文件24.3微量移液器及吸头。4.4紫外观察灯。4.5恒温培养箱。4.6普通冰箱和低温冰箱。4.7匀浆器。4.8离心机和离心管。5取样和制样对鱼的解剖采样，如果是体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取内脏(包括的规定采样。在15℃条件下，在1.5mLEppendorf管中首先加入25mg～100mg组织，加入150μLCTAB溶后置于25℃作用2h。6.1核酸抽提首先加350μL抽提液1(见第A.2章),充分混合至少30s;12000r/min离心5min,取上层水相；再加350μL抽提液2(见第A.3章),充分混合30s;12000r/min离心5min,取上层水相；然后加入1.5倍体积的-20℃无水乙醇，混匀后，-20℃放置6h以上；15000r/min离心30min,小心倒去上清将反应管置于PCR扩增仪。94℃变性4min;94℃变性1min、58℃退火1min,72℃延伸1min,35次循6.3设立对照6.3.1在6.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照，6.3.2取含有已知RSIV的病毒悬液或核酸作为阳性对照，阳性对照物由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。6.3.3取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照。6.3.4取等体积的水代替模板作为空白对照。6.4琼脂糖电泳用TBE(见第A.6章)电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖(含1μg/mLEB,见第A.7章)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μL样品和溴酚蓝指示剂溶液(见第A.8章)按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h,当溴酚蓝到达底部时停止。37.1在紫外灯下观察核酸带并判断结果4加巯基乙醇到终浓度为0.25%。A.2抽提液125:24:1的比例混合，密闭避光保存。TritonX-100用5.0mol/I的盐酸调pH到8.0。用水配制成10.0mg/mL的浓缩液。用时每10.0mL,电泳液或琼脂中加1.0μL,5(资料性附录)1GTGACTGCACACCAATGGACGTGGTCGACAAGGTGTATGTCATTCCAGATGGTGGCTGTGACTCGGATGTGGTGTCCCCTTCGTCATATACGGGCGCGTATGTGTATGAGGCGTGTACAACCCATGGACTTCCAGAGTCTGTATCCGAGTATTATCATATCCAAGAACATATGCTACAGCACCTTGGTAGCTGCGAACACGACCCACAGTGGCGTCGAGATTGGTGTCTTGCAATGTAACATGGCAGCGCTTCCGCGACGCGCCACCCAAGGATGCGTGAGAAATGAAGATCCAGTACGCAAGCATGACACCCTCGGTGGTTAAGTGTAACGTCTTCAGCTTCAGGTTCACGAAGGCGTGCTGCCACGGGTGCTGCGTAACCTGCTGGAGAGCAGGGCCCGCGTACGAGCTAGGGCAGTTCTGGACAAGAAGCAGCTGGC