仪器分析：第十七章 高效液相色谱分析

第十七章高效液相色谱分析§17-1概述§17-2高效液相色谱仪§17-3液-固色谱法§17-4液-液色谱法§17-5离子交换色谱法§17-6空间排阻色谱法§17-7液相色谱分离类型的选择一、高效液相色谱法的特点1.高压2.高速§17-1

概述对载液施加15~30MPa，甚至高达50MPa载液流速可达1~10mL·min-1，一般都小于1h。3.高效：可达5000~30000塔板/米2000－5000塔板/米（毛细管）2000塔板/米（填充柱）采用高灵敏度检测器，最小检测限可达10-11g4.高灵敏度：二、高效液相色谱与气相色谱的比较1.分析对象不同分析气体和沸点较低的化合物，及相对分子质量小于400的非离子型化合物。气相色谱法：20％不受分析对象挥发度和热稳定性的限制，能分析相对分子质量大于400的有机化合物。液相色谱法：适用于分析有机及生化试样大分子、不稳定的天然产物、高分子化合物、离子型化合物80％2.流动相不同

载气惰性，不参与分配过程，与组分分子没有亲合作用，仅起运载的作用；气相色谱：载液对组分分子有一定的亲合作用，与固定相争夺组分分子，因而增大了分离的选择性。液相色谱：通过调节流动相的极性、离子强度与pH值，来选择最佳的分离条件载液种类较多，因而选择较多；3.操作条件的差异1）液相色谱在室温下操作，较低柱温有利于分离；2）组分在载液中的扩散系数比在载气中小10-4倍，分子扩散小，但传质阻力大。3）载液粘度比载气大102倍，须采用高的入口压力4.分离机理的异同点可以根据离子交换作用或分子尺寸大小的差异而进行离子交换色谱和空间排阻色谱分离。三、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素1.涡流扩散项2.分子扩散项3.传质阻力项1）流动项传质阻力项a.流动的流动项中的传质阻力项

流路中间分子移动速度大，而接近固定相的分子移动速度相对较小。b.滞流的流动项中的传质阻力项2）固定相传质阻力项固定相表面的多孔性造成某一部分流动相滞留在固定液微孔内不再流动：

分子扩散项可忽略不计，影响柱效能的主要是传质阻力项与气谱相比：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)的曲型的H-u曲线

§17-2高效液相色谱仪

一、高压输液系统1.贮液器2.高压输液泵：压力：150～350×105Pa要求：流速恒定、压力平稳、无脉冲、流量可调节

用来贮存流动相，由玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯塑料等制成。1～2L恒流泵：一定条件下输出流量恒定恒压泵：输出压力恒定二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等进样方式：阀进样注射器进样作用：把分析试样送入色谱柱耐高压的六通进样阀三、分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等直型不锈钢管，内径2～6mm，柱长5～40cm减小填料粒度以提高柱效；装柱技术是获得高柱效的关键因素。发展趋势：四、检测系统紫外光度检测器，荧光检测器，电导检测器1.要求：灵敏度高，响应快，线性范围宽，噪声小，死体积极小，对温度和流量变化不敏感2.分类仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应a.溶质型检测器b.总体检测器对试样和流动相总的物理性质或化学性质有响应差示折光检测器五、附属装置包括脱气、梯度洗脱、再循环、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置梯度淋洗:在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂，按一定程序连续改变比例，使载液的极性、pH值、或离子强度相应变化，以达到提高分离效果和缩短分析时间的目的。一、分离原理根据各组分在固定相上吸附能力的不同进行分离以固体吸附剂为固定相，其表面具有活性吸附中心§17-3液-固色谱法适用于相对分子质量中等的油溶性试样、异构体极性:非极性:活性碳5～10μm的硅胶吸附剂包括硅胶、氧化铝及分子筛二、液-固色谱固定相三、液-固色谱流动相洗脱剂将试样溶解和分离；调节剂用以调节洗脱剂的极性和强度。1.尽量使用高纯度试剂(粘度尽可能小）作流动相。2.避免与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。3.试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀。4.应与所用检测器相匹配，价格便宜，清洁环保。§17-4液-液色谱法一、分离原理试样中各组分在两相中的分配系数存在差异，使各组分在两相间进行分配而得到分离。流动相与固定相互不相溶，两者之间有一个明显的分界面。二、液-液色谱固定相担体：薄壳型硅胶和全多孔型微粒硅胶β,β′－氧二丙睛、聚乙二醇、十八烷和角鲨烷早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。流动相对固定相的溶解度尽可能小，极性差别大亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。三、液-液色谱流动相§17-5离子交换色谱法一、分离原理固定相为离子交换树脂流动相为具有一定pH值的水的缓冲溶液各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。主要用来分离离子化合物或可离解的化合物1）全多孔型离子交换树脂以苯乙烯和二乙烯苯聚合形成的网状结构为基体，在基体上引入各种交换基团制成的球形微粒。2）薄膜型和表层多孔型交换树脂在直径约30μm的惰性固体核表面上涂一层树脂薄膜。表层多孔型树脂是在惰性固体核表面上先覆盖一层微球硅胶，再涂上一层树脂薄膜。二、离子交换色谱固定相用水缓冲溶液与甲醇或乙醇的混合液作流动相三、离子交换色谱流动相通过改变盐的浓度与pH值来控制组分保留值：增加pH值，组分在阳离子交换色谱上保留值降低，在阴离子交换色谱上保留值增加增加盐浓度，组分保留值降低；§17-6

空间排阻色谱法试样分子与固定相之间没有相互作用，仅依据试样分子的尺寸大小进行分离。固定相：凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的惰性的多聚体。一、分离原理流动相：与试样或固定相无作用，仅起载液作用。1）太大的组分分子，不能进入孔穴，最先流出；2）小个的组分分子能渗入到所有的孔穴中，最后流出3）中等大小的组分分子则可渗入到较大的孔穴内，但受到较小孔穴的排斥，所以介于上述两种情况之间流出。二、空间排阻色谱固定相1.软质凝胶：2.半硬质凝胶：聚苯乙烯凝胶等。3.硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠等。由某些高聚物制成，如葡萄糖凝胶、琼脂糖等特点：高的分离能力与较大的柱容量，不耐高压有坚硬的骨架，强度高，可耐高压，没有溶胀性适用于非有机溶剂，具有溶胀性，不能随意更换溶剂三、空间排阻色谱流动相不与试样或固定相之间相互作用，仅起载液作用。能完全溶解试样，粘度低，沸点比柱温高20～50℃四氢呋喃、十氢化萘、氯仿、二甲基甲酰胺§17-7

高效液相色谱分离类型的选择一、相对分子量1.分子量<200，热稳定：气相色谱法2.200<分子量<2000：液固吸附、液液分配、离子色谱3.分子量>2000：空间排阻色谱二、溶解度1.溶于水并能离解：离子色谱；2.