抗烟草花叶病毒植物源活性物质的筛选及其作用机制

抗烟草花叶病毒植物源活性物质的筛选及其作用机制采用半叶枯斑法对14科26种植物的粗提物进行抗烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)活性测定，结果表明，在4％浓度下，参试植物中有17种植物乙醇提取物对TMV的抑制率达50％以上，其中有9种抑制率达80％以上。采用不同极性的有机溶剂对抑制率在50％以上的植物乙醇提取物进行萃取并分别测定其体外抑制病毒的活性，发现对TMV具有体外抑制作用的成分大部分存在于正丁醇萃取层中，其次是水层，少数位于极性较小的氯仿萃取层中。17种植物的正丁醇萃取物去鞣质后有2种对TMV的抑制效果在60％以上，分别是三叶鬼针草(Bidenspilosa)84.5％和淫羊藿(Epimediumgrandifiorum)69.1％，其余的均低于30％，结果表明鞣质可能是许多植物粗提物体外抑制病毒的主要成分。叶圆片法测定抑制病毒复制的结果表明，在4％浓度下，26种植物中只有蟛蜞菊(Wedeliachinensis)、大蒜(Alliumsativum)和决明(Cassiatora)3种植物的乙醇提取物对烟草叶圆片中的TMV具有明显的抑制作用，其余植物的乙醇提取物无明显的抑制作用。通过有机溶剂萃取、聚酰胺吸附层析以及Sephadex-LH20凝胶层析，对三叶鬼针草中的黄酮甙进行提取，提取物经化学成分预试验和硅胶薄层层析分析，结果表明，提取物至少含有2种黄酮类物质。对提取的黄酮甙进行抗烟草花叶病毒活性测定，结果表明，三叶鬼针草中的黄酮甙对TMV具有明显的体外钝化作用，在100μg／mL浓度时，其抑制率为91.3％，但对烟草体内病毒复制无显著的抑制效果；聚丙烯酰胺凝胶电泳显示黄酮甙与病毒外壳蛋白混合的泳带比对照明显滞后，表明黄酮甙可能与TMV外壳蛋白结合；这种结合可以通过透析或萃取进行解离，使病毒恢复侵染力，表明黄酮甙对病毒无直接杀灭的作用；黄酮甙处理普通烟叶片12h后接种病毒具有降低病毒初侵染、延迟病害症状出现的作用。采用水蒸汽蒸馏法提取的大蒜精油经质谱鉴定，结果表明至少含有8种不同成分。从蟛蜞菊花中提取的1种结晶经化学、红外光谱、质谱鉴定，结果表明该结晶可能是1种分子量为256的内酯类化合物(WCLA)。分别对大蒜精油和WCLA的抗TMV活性进行测定，结果表明，在2000μg／mL浓度下大蒜精油对TMV的体外抑制率为74.8％，浓度为500μg／mL时，体外抑制率仅33.7％，福建农林大学硕士学位论文2而wCLA对TMv无明显的体外抑制作用。局部病斑法测定结果表明，400阳/mL浓度下，大蒜精油和wCLA对TMV的增殖抑制率分别为82.6%和69.1%:叶圆片法测定结果表明，400雌/mL浓度下大蒜精油对TMv复制的抑制率为76.5%，500阳/mL的wCLA对TMv复制的抑制率为71.4%。电镜观察发现，与对照相比，大蒜精油处理的TMV粒体部分发生断裂现象，表明大蒜精油可能破坏了病毒衣壳蛋白亚基之间的作用力，使病毒粒体衣壳蛋白结构松散，导致病毒粒体发生断裂;而WCLA处理的病毒与对照相比，病毒粒体数量和形态均无明显差异。试验结果还表明，大蒜精油和WCLA可影响TMV衣壳蛋白的体外聚合过程。喷施试验结果表明，接种TMv后30min、Zd分别喷施1000雌/mL的大蒜精油和wCLA，对烟草体内病毒的抑制率分别为49.5%和42.4%;烟草叶片中叶绿素总量分别提高51.5%