SN 1182.2-2004禽流感微量红细胞凝集抑制试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准禽流感微量红细胞凝集抑制试验国家质量监督检验检疫总局本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1弃去弃去禽流感微量红细胞凝集抑制试验2试剂和材料2.1试剂纯度所有化学试剂均为分析纯。2.2pH7.2,0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法见附录A。配制方法见附录A。2.41%鸡红细胞悬浮液将鸡红细胞泥用PBS稀释成1%悬浮液。2.5标准抗原2.6标准血清2.7被检血清2.7.2除鸡外其余禽的血清需先确定是否存在非特异性凝集。有特异性凝集的，血清按下列方法进行处理：每0.5mL血清加25μL鸡红细胞泥，轻轻振荡，静置30min,2000r/min离心2min～5min,红2.8器材3操作方法3.1微量血凝试验微量血凝试验见表1。孔号123456789抗原滴度(log₂)12345689对照PBS/μL抗原倍比稀释/μLPBS/μL1%鸡红细胞/μL作用时间及温度室温(约20℃)下静置40min左右判定举例十十+++十十十+++十+十十+十十++十十十十十十十十+2弃去弃去3.1.1在V型微量血凝板上，每孔加入PBS25μL。3.1.2孔1加禽流感标准抗原25μL,反复吹打充分混匀，移出25μL至孔2;吹打混匀，移出25μL至孔3,依次类推作等量倍比稀释至孔11,孔11弃去25μL。孔12不加抗原设立为红细胞对照。3.1.3每孔加入PBS25μL。3.1.4每孔加入1%鸡红细胞悬浮液25μL,立即置微型振荡器上振荡或手持血凝板绕圆圈混匀。3.1.5室温(约20℃)下静置40min左右；如果室温太高，可在4℃静置约60min。对照红细胞呈明显的圆点状时进行抗原效价判定。完全血凝的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，即一个血凝单位(HAU)。3.1.64HAU抗原的标定3.1.6.1根据3.1.5测定的抗原的血凝效价，计算4HAU抗原的稀释倍数。例如表1抗原效价为2⁷(1:128),其4个单位抗原效价为2⁵(1:32),则将抗原稀释32倍。3.1.6.2将25pL含4HAU的抗原用PBS做等量倍比稀释，使每孔(25μL)含有2HAU,1HAU,0.5HAU、0.25HAU,每孔补加PBS25μL,再加入1%鸡红细胞25μL,判定血凝图像与预期结果是否相符。2HAU、1HAU孔红细胞应出现完全凝集，0.5HAU孔红细胞应出现50%凝集，0.25HAU孔红细胞应不凝集。若与此不符，应重新配制抗原，测定效价。3.2微量血凝抑制试验微量血凝抑制试验见表2。表2禽流感微量血凝抑制试验孔号123456789血清稀释度(loga)1234567894HAU抗原/μL作用时间及混度室温(约20℃)下静置至少30min1%鸡红细胞/μL作用时间及温度室温(约20℃)下静置约40min判定举例—————十3.2.1在V型微量血凝板上，每孔加入PBS25μL。3.2.2孔1加入被检血清25μL,作等量倍比稀释至孔12。3.2.4室温(约20℃)下静置至少30min,或4℃静置60min。3.2.5每孔加入1%鸡红细胞悬浮液25μL,混匀，室温(约20℃)下静置40min左右；如果室温太高，可在4℃静置约60min。待对照红细胞呈明显的圆点状时判定结果。3.2.6每次测定应设已知滴度的阳性血清、阴性血清和红细胞对照(仅含25μL1%鸡红细胞和50μLPBS)。3.2.7结果判定3.2.7.1红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板时不流淌判为完全凝集，记作十十十十；75%凝集记作+十十；50%凝集记作土十；25%凝集记作十；红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时流淌判定为不凝集或血凝抑制，记作一。3.2.7.4血清的血凝抑制滴度≥2*(1:16),判为阳性。(规范性附录)A.1pH7.2,0.1mol/LP甲液：磷酸氢二钠(12H₂O)35.82g,氯化钠8.5g,加蒸馏水至1000mL。乙液：磷酸二氢钠(2H₂O)15.60g,氯化钠8.5g,加蒸馏水至1000mL。甲液72mL,乙液28mL,混匀。121℃高压蒸汽灭菌15min,置室温或4℃保存。葡萄糖2.05g柠檬酸钠(2H₂O)0.80g氯化钠0.42g蒸馏水加至100mL溶