SNT 2368-2009番茄斑萎病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准番茄斑萎病毒检疫鉴定方法2009-09-02发布国家质量监督检验检疫总局本标准由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局负1番茄斑萎病毒检疫鉴定方法2规范性引用文件3.1学名与分类地位4.1仪器设备4.2试剂5抽样与样品制备5.1抽样抽样按照SN/T2122的规定执行。5.2种子样品制备将种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集叶片用于5.3苗木样品制备26.1酶联免疫吸附测定见附录D。6.4生物学测定经检验确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃,病株在-20℃或3番茄斑萎病毒相关资料植物的940余种植物。菊科213种和茄科168种豆科50余种易感染TSWV。A.2病害症状番茄叶子呈青铜色卷曲、出现坏死条纹和斑点，叶柄、茎和茎尖产生深褐色条纹。与健康植株相比，被害植株矮小。红色或黄色的番茄成熟时表皮出现暗红色或黄色块斑。坏死严重时，导致植株死亡。辣椒整株矮化和黄化，叶片呈现褪绿线纹或花叶，并伴有坏死斑。实上，可见带有同心环或坏死条纹的黄斑。茎上有坏死条纹延伸至顶芽。成熟果莴苣植株受害后，从一侧叶片开始出现褪绿，并产生褐色斑纹。接长，呈现典型扭曲症。着变色延伸至新叶，之后这一侧停止生大岩桐受侵染叶片表现黄色或褐色斑或叶片变为栎叶状。凤仙花有些品种出现矮化叶基变黑或叶片出现褐色叶斑。花生芽坏死、叶褪绿、萎缩和植株死亡。菊花不同品种症状差异很大，常见的症献有茎黑色条纹和萎蔫。A.3分布地区番茄斑萎病毒是一种分布广泛且具有经济重要性的植物病毒，分布于欧洲和地中海地区、亚洲、非A.4传播方式TSWV容易通过介体——蓟马(主要包括Thripstabaci、T.setosus、T.parmi、Frankliniellaschultzei、F.occidentalis、F.fusca和Scirtothripsdorsalis)以持久性4双抗体夹心酶联免疫吸附测定B.1试材B.1.1酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。B.1.2包被抗体特异性的番茄斑萎病毒抗体。B.1.3酶标抗体B.1.4底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)PVP(MW24000～40000)20g叠氮钠(NaN₃)碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g蒸馏水定容至1L,4℃储存。B.1.7PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4)磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g叶温-200.5mL蒸馏水定容至1L。BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉2.0g叠氮钠(NaN₃)二乙醇胺97mL5B.2程序B.2.1包被抗体B.2.2样品制备待测样品按1:10(重量：体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min离心10min,上清37℃孵育4h,酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5加底物在不同的时间内如30min、1h、2h或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显缓冲液孔和阴性对照孔的ODos值小于0.15,当阴性对照孔的OD4os值小于0.05时，按0.05计6Tris-HClEDTA亚硫酸钠(Na₂SO₃)C.1.250×TAE冰醋酸Na?EDTA·2H₂O(规范性附录)加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1×TAE。C.1.36×加样缓冲液溴酚蓝/40%(质量浓度)4mol/L氯化锂在4℃下过夜沉淀；4℃下13000g离心30min;用200μL含1%十二烷基硫酸钠C.2.2RT-PCR反应L1TSWVR5'-AATTGCCTTGCAACCAATTC-3’L2TSWVF5’-ATCAGTCGAAATGGTCGGCA-3’C.2.2.2cDNA合成7表C.1各组分浓度和用量试剂名称用量/μLdNTPs(3.5mmol/L)引物5×M-MLVBufferM-MLV(200U/μL)RNaseinhibitor(120U/μL).5pg=1.0gC.2.2.3在冰上依次将表C.2组分加入上述RT混合液中。充分混匀后进行下列热循环：94℃试剂名称用量/pL引物Polymerase(5U/μL)总体积加入溴化乙锭浓度为0.5μg/mL,混为，倒入已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的TAE(缓中液没过潍胶表面约1mm)。C.3结果判断8(规范性附录)实时荧光RT-PCR(TaqMan)检测植物和单个蓟马中的TSWVTSWV-CP-17FTSWV5'-CTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGA-3’TSWV-CP-73T5'-AGGTAAGCTACCTCCCAGCATTATGGCAAG-3’蓟马引物和探针—肌动蛋白基因内设计：WFT-RNA-25FWFT-actin5'-GGTATCGTCCTGGACTCTGGTG-3’WFT-KNA-93RWFT-actin-C5'-GGGAAGGGCGTAACCTTCA-3’WFT-RNA-48TWFT-actin5’-CGGTGTCTCCCACACTGTCCCCA-3’D.2RNA提取取100mg～200mg植物叶片组织在液氮中研磨成粉状。用1mL提取缓冲液混合样品。65℃孵育10min～15min。三氯甲烷：异戊醇(24:1)抽提两次。水相用等体积4mol/L氯化锂4℃下过夜沉和300μL冷异丙醇在一20℃下孵育30min。13000g,4℃下离心10min,70%D.2.2从蓟马中提取chelexresin(Chelex100,Biorad)(50μL50%w/vslurry)。94℃加热5min。13000g,4℃离心5min。D.3实时荧光RT-PCR(Taq酶)试验表D.1各组分浓度和用量终浓度用量/μLTSWV-CP-100RTSWV-CP-17-FTSWVCP-73T(FAMlabel)WFT-RNA-25FWFT-RNA-93R-CWFT-RNA-48T(VIClabel)MgCl₂25nmol/LPCRcorereagentkit9试剂名称终浓度用量/μLAmpliTaqGoldTaqPolymeraseMMLV总体积按下列程序进行实时RT-PCR:48℃30min;95℃10min;60℃1min;95℃15s,40个循环，病叶加1:1(质量：体积)的磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH7.2)于研钵中充分研碎，在待接种植物矮牵牛(Petunia