Maresin1诱导的炎症消散对阿尔茨海默病的保护作用

Maresin1诱导的炎症消散对阿尔茨海默病的保护作用慢性炎症是AD的主要病理改变之一,近年研究显示导致慢性炎症的主要原因是炎症消散障碍。炎症消散由炎症消散因子SPMs介导。已有研究证实炎症消散因子MaR1能提高神经元生存率并增强小胶质细胞对Aβ42的吞噬,但是MaR1在AD患者海马和内嗅皮质显著减低,MaR1降低可引起Aβ清除障碍、过度沉积,进而加重炎症反应,导致慢性炎症。因此给予MaR1诱导炎症消散可能成为治疗AD的新方法。研究目的:明确MaR1对小胶质细胞趋化、激活、表型的极化、炎性因子分泌的影响和相关信号通路,进而对AD小鼠行为学的影响。研究方法:第一部分体外实验:1.MaR1对小胶质细胞趋化的影响的研究:原代神经元种于6孔培养板底部,趋化小室置于6孔板中,将绿色荧光标记物CFSE标记的小胶质细胞种于趋化小室中。实验分八组:Vehicle组(即正常对照组)、Aβ42组、Aβ42+低浓度MaR1组(0.005μmol/L)、Aβ42+中浓度MaR1组(0.05μmol/L)、Aβ42+高浓度MaR1组(0.5μmol/L)、低浓度MaR1组(0.005μmol/L)、中浓度MaR1组(0.05μmol/L)、高浓度MaR1组(0.5μmol/L)。于6、16、24h后流式细胞仪检测CFSE阳性细胞数分析小胶质细胞趋化。2.MaR1对小胶质细胞表型及激活“开-关”信号的影响:前期实验发现MaR1浓度变化对小胶质细胞趋化影响不大,故以下实验MaR1只采用一个浓度;只在6h时间点各组趋化的小胶质细胞数目有统计学差异,故以下实验只选取6h时间点。小胶质细胞与神经元共培养24h后,实验分组:Vehicle组、Aβ42组、MaR1组、Aβ42+MaR1组。6h后流式细胞仪分析小胶质细胞激活“开-关”信号CD200-CD200R、表型CD40、CD183变化;CBA方法检测共培养细胞上清中炎性因子、趋化因子改变;蛋白质组学筛选出现改变的蛋白通路,并用westernblot方法进行验证。第二部分体内实验:3-4月龄雄性C57BL6/J小鼠40只,随机分为Vehicle组、Aβ42组、MaR1组、Aβ42+MaR1组。Aβ42组小鼠采用双侧海马注射Aβ42制作AD动物模型,MaR1组和Aβ42+MaR1组于海马注射前脑室内注射MaR1。造模后7d利用水迷宫评价小鼠行为学改变;Fluoro-JadeB染色及免疫组织化学染色方法观察海马和皮层神经元退变和胶质细胞活化;CBA和ELISA方法检测海马和皮层脑组织炎性因子、趋化因子水平;westernblot方法检测体外实验中蛋白质组学发现改变的蛋白通路。研究结果:第一部分体外实验:1.与Vehicle组相比,Aβ42组趋化的小胶质细胞数目增加(P<0.05);Aβ42+低浓度MaR1组、Aβ42+中浓度MaR1组、Aβ42+高浓度MaR1组均较Aβ42组趋化的小胶质细胞数目降低(P<0.05),但三种浓度组之间趋化细胞数目无显著性差异。与Vehicle组相比,未加Aβ42的单纯低浓度MaR1组、中浓度MaR1组和高浓度MaR1组趋化的小胶质细胞数目均降低,但只有低浓度MaR1组和高浓度MaR1组达到统计学意义(P<0.05),且高浓度MaR1组降低小胶质细胞趋化作用更明显(P<0.01)。2.在共培养细胞模型中,与Vehicle组相比,Aβ42组CD200R表达降低(P<0.05);Aβ42+MaR1组较Aβ42组CD200R表达升高(P<0.05)。四组CD200、CD40、CD183表达未见显著性差异。3.在共培养细胞模型中,与Vehicle组相比,Aβ42组促炎性细胞因子TNF-ɑ、IL-6、趋化因子MCP-1分泌增加,抗炎性细胞因子IL-10分泌降低(P<0.05);与Aβ42组相比,Aβ42+MaR1组TNF-ɑ、IL-6分泌降低(P<0.05),MCP-1分泌有降低趋势,IL-10分泌有增加趋势,但是未达到统计学意义;与Vehicle组相比,单纯MaR1组IL-6分泌降低(P<0.01)。4.定量蛋白质组学揭示了四组间不同的分子变化:与Vehicle组相比,Aβ42组p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT表达降低(P<0.01),p-p38/total-p38、p-ERK/total-ERK、p-mTOR/total-mTOR、caspase3、p75NTR、Cdc42表达升高(P<0.05);与Aβ42组相比,Aβ42+MaR1组p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT、p-ERK/total-ERK表达升高(P<0.05),p-p38/total-p38、p-mTOR/total-mTOR、caspase3、p75NTR、Cdc42表达降低(P<0.05)。Westernblot验证结果与蛋白质组学结果趋势一致。第二部分体内实验:1.行为学:Morris水迷宫实验连续训练5天后,各组小鼠的逃避潜伏期逐渐缩短。在第5天,与Vehicle组相比,Aβ42组逃避潜伏期明显延长(P<0.05);与Aβ42组相比,Aβ42+MaR1组逃避潜伏期明显缩短(P<0.01);Vehicle组和MaR1组逃避潜伏期无明显差异。在探索实验中,Aβ42组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间明显少于Vehicle组(P<0.001);Aβ42+MaR1组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间高于Aβ42组(P<0.05);Vehicle组和MaR1组小鼠穿越平台次数及目标象限停留时间无明显差异。2.病理:(1)Fluoro-JadeB染色:在海马与皮层,与Vehicle组相比,Aβ42组退变神经元数目增多(P<0.001);Aβ42+MaR1组较Aβ42组退变神经元数目减少(P<0.001);Vehicle组和MaR1组退变神经元数目无明显差异。(2)免疫组织化学染色:在海马与皮层,与Vehicle组相比,Aβ42组CD11b和GFAP阳性细胞面积百分比升高(P<0.01);Aβ42+MaR1组较Aβ42组CD11b和GFAP阳性细胞面积百分比降低(P<0.01);Vehicle组和MaR1组CD11b和GFAP阳性细胞面积百分比无明显差异。3.脑组织炎性因子与趋化因子分泌:在海马与皮层,与Vehicle组相比,Aβ42组TNF-ɑ、IL-6、MCP-1升高(P<0.05);Aβ42+MaR1组较Aβ42组TNF-ɑ、IL-6、MCP-1降低(P<0.05);Vehicle组和MaR1组TNF-ɑ、IL-6、MCP-1无明显差异。在海马与皮层,与Vehicle组相比,Aβ42组IL-2、IL-10升高(P<0.05);在海马,MaR1组较Vehicle组IL-2、IL-10升高(P<0.05);在皮层,Aβ42+MaR1组较Vehicle组IL-2、IL-10升高(P<0.05)。4.蛋白通路改变:与Vehicle组相比,Aβ42组p-PI3K/total-PI3K和p-AKT/total-AKT表达降低(P<0.001),p-p38/total-p38、p-ERK/total-ERK、p-mTOR/total-mTOR、caspase3表达升高(P<0.01);与Aβ42组相比,Aβ42+MaR1组p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT和p-ERK/total-ERK表达升高(P<0.05),p-p38/total-p38、p-mTOR/total-mTOR、caspase3表达降低(P<0.05);与Vehicle组相比,MaR1组p-ERK