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利用CRISPR/Cas9技术构建纯合bmp9基因敲除C57BL/6小鼠肝纤维化是一种由慢性肝脏损伤引起的病理变化,常见于酒精肝、脂肪肝及病毒性肝炎中。目前关于肝纤维化影响因子的报道有很多,但这些因子大多都与骨形态发生蛋白9(bonemorphogeneticprotein9,BMP9)的调控密切相关,BMP9或直接或以调控通路蛋白的形式间接参与了其中很多分子的转录、翻译和激活调控。BMP9是一种主要由肝脏表达分泌的生长分化因子,之前的研究大多集中于其参与干细胞分化及成骨形成过程,它在肝脏疾病尤其是慢性肝纤维化病程中的作用机制还鲜有报道。第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种方便快捷的基因操作工具,它的出现极大地方便了生物科学研究。此技术只需针对靶序列进行sgRNA设计,科研人员就可以对几乎所有感兴趣的基因进行编辑和修饰,从而实现定点敲除或敲入。本研究通过胚胎显微注射bmp9sgRNA和Cas9mRNA的方法,成功建立纯合的bmp9基因敲除的C57BL/6小鼠,同时通过优化条件建立起成熟的基因敲除动物操作体系,为后期阐明BMP9参与调节肝纤维化的分子机制和具体的通路研究奠定基础,也为其它基因修饰动物模型的制作提供经验指导。研究工作取得如下结果:1.CRISPR/Cas9基因敲除动物模型制作体系的建立根据NCBI和Ensemble数据库下载到的bmp9cds序列信息,使用sgRNA在线设计评价平台设计并筛选出最佳的sgRNA序列,通过PCR和T7转录酶体外转录的方法获得纯化的bmp9sgRNA,将它与Cas9mRNA混合后显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵细胞,将成活的受精卵细胞回植到受体ICR母鼠体内待其生产。2.纯合bmp9基因敲除小鼠的鉴定和扩群受体ICR小鼠生产后,提取后代小鼠基因组DNA测序进行基因型鉴定,选取F0代杂合敲除小鼠中确定发生移码突变的个体进行回交育种并挑选F2代中有表型变化且基因型鉴定为纯合敲除的小鼠进行WesternBlotting验证。对F2代扩群后的F3代小鼠肝脏组织进行WesternBlotting和免疫组织化学验证,确定敲除动物种群建立成功。综上所述,本研究成功设计bmp9sgRNA,体外转录并验证靶向于bmp9基因1号外显子sgRNA的敲除活性,建立起成熟的动物敲除模型制作体系。对生产的后代小鼠从基因水平、蛋白水平和组织学水平进行鉴定,确定基因修饰后小鼠体内BMP9蛋白表达量降低甚至不表达,对纯合

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