基于TARGET转录组数据的儿童骨肉瘤预后预测与决策支持

基于TARGET转录组数据的儿童骨肉瘤预后预测与决策支持摘要骨肉瘤是发生在20岁以下青少年或儿童的一种恶性骨肿瘤，也叫成骨肉瘤，是小儿骨恶性肿瘤中最多见的，约为小儿肿瘤的5%。该疾病的显著症状是因肿瘤组织不断侵蚀和破坏骨皮质而带来的源源不断的疼痛。骨肉瘤一旦经病理证实，就应该立即开始前期的化学治疗和手术治疗。虽然放化疗具有一定效果，但是总体预后不佳，需对其分子机制开展进一步的研究。近年来，随着组学技术的不断发展，对于各种不同的生物数据获取与分析的方法日益成熟，在癌症的诊治过程中，通过对组学数据进行分析与挖掘，利用处理后的患者数据建模并且对其进行预后预测，能够对患者提供更精准的临床决策支持。基于此，本文利用来自TARGET数据仓库中的88例儿童骨肉瘤患者的转录组数据，利用生物信息学和数据分析、挖掘方法，通过对儿童转录组数据进行分析，找出正常儿童和患病儿童的差异lncRNAs，然后对有差异的lncRNAs进行单因素和多因素Cox生存分析，建立骨肉瘤预测的Cox生存模型，按风险情况将患者病情划分，对患者的生存情况进行预测，并对后期医生的临床决策提供支持。关键词：骨肉瘤；临床决策支持；预后预测

AbstractOsteosarcomaisatypeofmalignantbonetumorthatoccursinadolescentsorchildrenundertheageof20,alsoknownasosteosarcoma.Itisthemostcommonmalignanttumorofboneinchildren,about5%ofchildren'stumors.Theobvioussymptomofthediseaseisthecontinuouspaincausedbythecontinuouserosionanddestructionofthebonecortexbythetumortissue.Oncetheosteosarcomahasbeenconfirmedbypathology,earlychemotherapyandsurgeryshouldbestartedimmediately.Althoughchemoradiotherapyhascertaineffects,theoverallprognosisispoor,andfurtherresearchonitsmolecularmechanismisneeded.Inrecentyears,withthecontinuousdevelopmentofomicstechnology,methodsforacquiringandanalyzingvariousbiologicaldatahavebecomeincreasinglymature.Intheprocessofcancerdiagnosisandtreatment,byanalyzingandprocessingomicsdata,theprocessedpatientdataisused.Modelingandpredictingprognosiscanprovidepatientswithmoreaccurateclinicaldecisionsupport.Basedonthis,thisarticleusesthetranscriptomedataof88childrenwithosteosarcomapatientsintheTARGETdatawarehouse,andusesbioinformaticsanddataanalysisandminingmethodstoanalyzethechildren'stranscriptomedatatofindnormalandsickchildrenDifferentlncRNAs,andthenperformunivariateandmulti-factorCoxsurvivalanalysisonthedifferentlncRNAs,establishaCoxsurvivalmodelforosteosarcomaprediction,dividethepatient'sconditionaccordingtotherisksituation,predictthepatient'ssurvival,andpredictthefuturedoctorProvideclinicaldecisionsupport.Keywords:Osteosarcoma;ClinicalDecisionSupport;PrognosisPrediction

目录摘要 IAbstract II第1章绪论 11.1研究背景及意义 11.2国内外研究现状 21.3本文的主要工作 31.4本文的结构安排 3第2章基于组学数据的临床决策支持系统 42.1临床决策支持系统的概念与分类 42.2基于组学数据的临床决策支持系统的研究现状 42.3基于组学数据的临床决策支持系统总体设计 5第3章数据与方法 73.1数据获取与下载 73.2数据预处理 73.2.1数据的筛选 73.2.2数据的处理 73.3统计分析（生存分析） 83.4富集分析 9第4章实验结果与讨论 104.1确定生存相关lncRNA 104.2构建生存模型 114.3模型整体验证 124.4模型独立性验证 134.5富集功能分析 144.6讨论 17结语 18参考文献 19附录： 21致谢 23

第1章绪论1.1研究背景及意义骨肉瘤是一种来源于间充质细胞的恶性骨肿瘤，主要见于儿童和青少年，发病率为百万分之三，我国每年有近万人患病，患病部位以肢体长管状骨干骺端为主，在盆骨、脊柱、下颚等部位也较为常见。目前，该病的病因和致病性尚不清楚，医生的治疗手段有限，在患者患病初期，病灶通常通过手术的方式进行切除，而晚期等不可手术的情况下患者只能采取放疗与化疗的方式。针对肿瘤生长在局部的特性，采用放射治疗的方法更为适宜，但效果不理想，成功的概率仅为20%~30%，以至于患者的预后情况较差、死亡率高[1-2]。由此可见，骨肉瘤十分是一种极其凶险的肿瘤，人们目前需要更加有效的诊断策略与治疗手段。目前，癌症的发病率逐年升高，对癌症患者进行精确的预后预测已成为目前最为重要的问题。预后，指的是预测疾病的可能病程和结局。不仅包括在某个时间段内预测某种发生的可能性等时间线索，还包括判断疾病的特定结果[3]。预后预测的好坏很大程度上能决定癌症患者后续治疗的成功与否。预后预测除了关注患者的临床信息外，还可以利用患者肿瘤发展不同时期的组学数据进行系统的分析。随着数据量近年来的爆炸式增长，数据更新速度不断加快，已超出某一特定领域内人类所掌握常见及罕见的治疗相关分子生物学类型范围，因此精准医学需要依赖计算机驱动的临床决策支持系统(clinicaldecisionsupportsystem，CDSS)来满足相关知识迅速及时地传递和使用[4]。这一步骤的构建包括收集各种医学数据，构建相应的各种数据结构，最后开发出适合实际情况的临床决策工具。在此前提下，将患者个人的组学数据与临床决策支持系统联系起来，这就构成了基于组学数据的临床决策支持系统，该系统可以为患者的治疗提供更精确的介入信息，有助于进一步了解肿瘤的分子机制，提高临床决策支持的准确度，改善用药的合理性，促进后期治疗方案的指定的科学性，为医生提供更加准确科学的治疗建议。因此，通过对癌症患者的组学数据进行数据分析与数据挖掘，利用筛选得到的差异标志物进行特征选择并构建癌症诊断预测模型，从而建成基于组学数据的临床决策支持系统，该系统能够对患者进行较好的预后预测与精确的诊断与治疗。本文采用基于R语言的数据分析和挖掘方法，开展儿童骨肉瘤的预后机制的研究，目的是建立对于医生的临床诊断和药物研发具有帮助的决策支持系统（模块）。建立的决策支持系统可以用于其他癌症和疾病，具有较好的实践意义和推广价值。1.2国内外研究现状组学数据是一个庞大的数据概念，其包括生命体征，检查检验，医嘱，基因组学，转录组学，蛋白组学等数据[5]。针对冗杂的癌症患者的组学数据，2006年，隶属于美国健康研究院（NationalInstitutesofHealth，NIH）的美国国家癌症研究所（NationalCancerInstitute，NCI）和国家人类基因组研究所（NationalHumanGenomeResearchInstitute，NHGRI）发起了癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）计划。TCGA计划的目的主要是得到一个全面的、多维的，针对多种癌症基因组的图谱，至今已经收录了33类多达2.5PB的不同类型的癌症数据。利用癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）计划的这些分子分析数据能够对癌症患者进行精准的预后。传统上的预后大多数基于临床因素，例如：年龄，肿瘤等级,治疗方法等。目前通过结合分子信息，能够达到更好的预后效果。2010年，WeigelMT1与DowsettM.通过对乳腺癌中的雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）以及人类表皮生长因子受体2（HER2）的生物标志物进行研究，发现其对乳腺癌的预后预测具有重要的价值，并在临床应用中取得了较好的效果[6]。2017年，施达通过分析肾透明细胞癌患者数据中lncRNAs的表达值信息，将总的数据集分为训练集和测试集，并对训练集与测试集进一步统计学分析与研究，找到了五个与肾透明细胞癌预后相关的重要lncRNAs。以这五个lncRNAs为基准，将所有的患者分为高风险和低风险两组。进行统计学分析后发现高风险组患者与低风险组患者的生存率存在显著差异，与其他临床因素相比，这五个与肾透明细胞癌预后相关的重要lncRNAs具有独立的预后价值[7]。2018年，房晓南通过分析肝细胞癌患者的lncRNA表达谱，通过单因素和多因素Cox生存分析，发现并验证了10例与肝细胞癌预后相关的重要lncRNA。根据在这10个lncRNA上建立的风险计算模型，可以将肝细胞癌患者样本分为高风险和低风险组，这两组患者的生存率显着不同。为进一步了解肝细胞癌涉及的分子机制以及改善肝细胞癌患者的诊断，治疗和预后提供了数据[8]。综上所述，通过与临床数据紧密结合，组学数据在癌症的预后预测和诊断治疗中发挥了重要的作用。1.3本文的主要工作本文利用生物信息学和数据分析、挖掘方法，通过对来自TARGET数据仓库中的88例儿童骨肉瘤患者的转录组数据进行分析，找出正常儿童和患病儿童的差异lncRNAs，建立一个基于TARGET数据库转录组数据的儿童骨肉瘤预后预测与临床决策支持模型，然后对有差异的lncRNAs进行单因素和多因素Cox生存分析，进而建立骨肉瘤预测的Cox生存模型，通过建立的Cox生存模型可以按风险情况将患者病情划分，对患者的生存情况进行预测，并对后期医生的临床决策提供支持。1.4本文的结构安排论文在结构上共分为五个章节。第一章是论文的绪论，其介绍了针对儿童骨肉瘤进行预后预测的研究背景和意义，表明本论文的目的是为了完善儿童骨肉瘤的预后机制，建立对于医生的临床诊断和药物研发具有帮助的决策支持系统（数据挖掘模块），有助于医生对患者疾病的诊断和预测。第二章是有关基于组学数据的临床决策支持系统的相关介绍，以及基于组学数据的临床决策支持系统的总体设计。第三章是对本文所使用儿童骨肉瘤患者的数据来源的介绍以及进行统计学分析的理论依据。第四章是依照第三章的理论依据进行统计学分析的过程，通过统计学分析得出来的数据建立生存模型并进行进一步的独立性检验。第五章对本文进行总结，指出尚存在的不足之处，并对基于组学数据的临床决策支持系统的未来发展进行展望。

第2章基于组学数据的临床决策支持系统2.1临床决策支持系统的概念与分类临床决策支持系统即CDSS（ClinicalDecisionSupportSystem,CDSS），一般来说，它是指支持临床决策的计算机系统。该系统充分利用现有的计算机技术，通过人机交互的方式解决半结构化或非结构化的医学问题，提高了决策效率[5]。基于计算机的临床决策支持被定义为应用信息和通讯技术为医疗健康带来相关知识的实践活动。临床决策支持系统以决策支持基础可以划分为两类：一类是以知识为决策支持基础的系统称为knowledge-basedCDSS；另一类以机器学习等算法或统计类算法为决策支持基础的称为non-knowledgeCDSS[9]。基于知识库的CDSS主要由知识库、推理机和人机交流接口三个部分组成。知识库(KnowledgeBase)是知识工程中结构化，易操作，易利用，全面有组织的知识集群，是针对某一领域问题求解的需要，采用某种知识表示方式在计算机存储器中存储、组织、管理和使用的互相联系的知识片集合。这些知识片包括与领域相关的理论知识、事实数据，由专家经验得到的启发式知识，如某领域内有关的定义、定理和运算法则以及常识性知识等。基于CDSS的临床知识库是以患者诊断、主诉、症状、检验、检查、药品、指南和病例报告为基础，通过整合设计，关联知识点，为医生临床诊断提供决策支持以及决策依据，同时方便医生查找相关知识及病例报告，辅助医生临床诊断[10]。基于非知识库的CDSS系统在一般情况下多采用人工智能的形式。近年来，在CDSS的研究和开发中，这种人工智能被称为机器学习，通过机器学习的方法能够使计算机可以获得经验中以及其他临床数据中存在的知识。机器学习常用的方法有人工神经网络、遗传算法、贝叶斯网络、产生式规则、逻辑条件、因果概率网络等[11]。这两类临床决策支持系统各有优劣：基于知识库的CDSS由于有了相应专家的专业知识，对于临床诊疗具有更高的准确性，但是其也受限于知识库是有限的，对于知识库外的数据不能提供更好的参考；基于非知识库的CDSS不会受限于知识库的大小，其能够利用人工智能的方法填补缺失数据并可以对数据进行预测。2.2基于组学数据的临床决策支持系统的研究现状在高通量测序技术的快速发展下，涌现出了大量的多组学数据，如基因组、转录组、表观组、代谢组和蛋白组等，同时也出现了许多具有代表意义的国际项目，如DNA元件百科全书计划(TheEncyclopediaofDNAElements,ENCODE)[12]和国际人类基因组单体型图计划(HaplotypeMap,HapMap)[13]等。随着数据的不断积累和基础研究的不断突破，人类对疾病的诊治迈入了精准医学时代。医生可以结合患者的组学数据[14]、表型数据、临床诊疗数据、电子病历数据及影像数据等从多方面上对疾病进行更为精准、详细的诊断与治疗。在此基础上，一个个优秀的临床决策支持系统如雨后春笋般不断涌现，基于数据分析和数据挖掘的人工智能方法在基础医学研究领域得到了迅速的发展。计算机通过对数据进行数据分析和数据挖掘后，能够从数据中提取有用的信息从而构建成模型，再通过使用大量的数据来提高与完善模型性能，从而达到诊断与预测疾病的预期，最终实现为临床决策支持提供技术支持的目的[15]。2014年，HanLeng和YuanYuan等在研究假基因的表达和临床相关的肿瘤亚型泛癌分析中，为了评估假基因表达谱对于两种子宫内膜样腺癌组织学亚型的预测效力，研究人员使用多种机器学习算法，其中逻辑回归算法得到的假基因表达谱可以准确区分两种组织学亚型，其AUC达到了0.892。在独立测试集上，逻辑回归算法展示出最佳性能，表明利用逻辑回归得到的假基因表达谱能够有效捕捉临床相关信息，获得有意义的肿瘤亚型，帮助医生和患者选择适当的临床治疗方案[16]。2017年，XuRui-Hua等在肝癌的早期筛查模型中，利用肝癌患者和正常人血液样本中的DNA甲基化数据和生存数据，通过随机森林和LASSO等机器学习方法，得到了用于肝癌早期筛查、风险评估和预后监测的模型。在随机森林分析中，利用OOB(outofbag)误差[17]作为最小化准则，从变量森林中进行变量消去，通过设置变量每次迭代的下降分数为0.3，将变量从随机森林中缩减，最终从450000个DNA甲基化位点中筛选出了10个甲基化位点作为生物标志物，进而使用逻辑回归构建了肝癌诊断预测模型，辅助医生进行临床决策。综上所述，基于组学数据的临床决策支持系统主要增加了对组学数据进行数据挖掘与数据分析的过程。通过增加这个过程，我们能够发现癌症在不同阶段的差异标志物，利用筛选得到的差异标志物进行特征选择并构建癌症诊断预测模型能够帮助医生更加准确地诊断与预测疾病、进行预后预测[18]。2.3基于组学数据的临床决策支持系统总体设计基于组学数据的临床决策支持系统主要有人机交互界面、患者组学数据库、患者临床数据库、数据处理机制和解释器构成。人机交互页面主要是针对医生设计和使用，医生可以通过人机交互页面将患者通过化验等方式得到的组学数据输入到患者组学数据库中，同样，解释器处理后的对临床有用的信息也可以通过人机交互界面较为直接的展示给医生，对医生提供精准的临床决策支持。患者组学数据库负责存储患者的组学数据，其中包括：基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学、免疫组学、糖组学和RNA组学等数据。患者临床信息数据库负责存储患者的临床信息，其中包括：年龄、身高、体重、患病时间、患病部位、患病的阶段与进行的相应治疗等。数据处理机制的作用是对患者的临床数据和组学数据首先进行标准化，接着采用数据分析和数据挖掘的方法对标准化后的数据进行分析与处理，基于处理后的数据进一步生成风险预测模型，然后利用大量数据对模型进一步完善，以达到提供临床决策支持的目的。解释器是对数据处理机制得出的结果的进一步解释和说明，对复杂冗余的结果进行简化并筛选出对医生有帮助的数据，方便医生的使用。图2-1基于组学数据的临床决策支持系统总体设计本文主要研究数据处理与生存模型构建这一过程。通过对患者的组学数据和临床数据进行处理得到标准化数据，利用得到的标准化数据进行数据分析与数据挖掘后利用机器学习的算法生成癌症的生存预测模型，使医生能够根据该模型对患者进行有效的临床决策。图2-2组学数据与临床数据的处理与生存模型构建

第3章数据与方法3.1数据获取与下载本文的实验数据来自于TARGET数据库，TARGET数据库针对儿童肿瘤,主要疾病项目包括急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia),急性骨髓性白血病(AcuteMyeloidLeukemia),肾脏肿瘤(KidneyTumors),成神经细胞瘤(Neuroblastoma),骨肉瘤(Osteosarcoma)等[19]。本文通过直接调用R的TCGABiolinks包下载数据，使用GDC官方API下载数据，能够保证数据的及时性和准确性，同时TCGABiolinks包也提供数据整理、聚类分析、差异分析、富集分析等功能。下载完成后共得到88例儿童骨肉瘤患者的数据。3.2数据预处理3.2.1数据的筛选1.首先，对本文所用到的儿童骨肉瘤患者的临床数据进行筛查，由于一些临床因素（如患者的性别，生存状态等）在本次实验中是不可或缺的，我们对缺失这些因素的患者进行剔除，最后剩余86例儿童骨肉瘤患者的临床数据。2.接着，对本文所用到的儿童骨肉瘤患者的lncRNA的表达数据进行筛查，将下载的lncRNA表达数据与从GENECODE（/releases/22.html）上下载的参考lncRNA进行比对，目的是减少冗余，最后保留至少有25%且表达量≥2的lncRNA，经过筛选后共保留了8457个lncRNA。3.最后，对本文所用到的儿童骨肉瘤患者的蛋白编码基因的表达数据进行筛查，将整理后的蛋白编码基因与从ENSEMBL(/Help/Faq?id=468)上下载的参考蛋白编码基因（GRCh38）进行对比，去掉ENSEMBL参考蛋白编码基因中没有的蛋白编码基因，经过筛选后共保留了17987个蛋白编码基因。经过对数据的筛选，本文以86个儿童骨肉瘤患者的临床数据，8457个lncRNA和17987个蛋白编码基因作为研究对象进行研究。3.2.2数据的处理首先对临床信息数据和基因表达量信息进行合并，实现合并代码如下：clin<-clin[clin$bcr_patient_barcode%in%datExpr$bcr_patient_barcode,]exprSet<-merge(clin,datExpr,by.x="bcr_patient_barcode",by.y="bcr_patient_barcode")为了保证信息的准确性，合并前首先以基因表达量中的bcr_patient_barcode为基准，在临床信息中提取出基因表达量中存在的所对应bcr_patient_barcode的临床信息，然后再依照bcr_patient_barcode进行对临床信息和基因表达量信息进行合并。将经过筛选后的全部86个儿童骨肉瘤患者在保证临床信息中的VitalStatus较为均衡的前提下（即VitalStatus为Alive与Dead的患者在两组中占的比重大致相当）随机分成各包含43个患者样本数据的训练集和测试集。3.3统计分析（生存分析）基于随机分组得到的训练集，使用单因素Cox回归分析函数计算lncRNA的表达水平与儿童骨肉瘤患者群体生存之间的关系。单因素Cox回归分析函数的结果的P-Value值如果小于0.001，那么就说明这两者之间存在显著关系，即这些分析结果显著的lncRNAs与儿童骨肉瘤患者的生存状态息息相关。在进行完单因素Cox回归分析之后，利用单因素Cox回归分析得到的显著lncRNAs进行多因素Cox回归分析。在多因素Cox回归分析的过程中，一步选择p值更小的lncRNAs，并记录下这些lncRNAs的风险分数估值以用来构建儿童骨肉瘤患者的生存风险评分公式。通过该公式可以将儿童骨肉瘤患者划分为低风险组和高风险组两类，使用kaplan-meier生存分析曲线可以将这两组不同风险患者的生存预期差异较直观的展示出来。为了进一步验证所筛选的lncRNAs预后分析能力是否独立于其他临床变量如性别等指标，利用多因素Cox回归分析加以验证。生存分析的主要目的在于研究变量X与观察结果即生存函数(累积生存率)S(t,X)之间的关系。当S(t,X)受很多因素影响，即X=(X1,…,Xm)为向量时，传统的方法是考虑回归方程——即诸变量Xi对S(t,X)的影响。但由于生存分析研究中的数据包含删失数据。且时间变量t通常不满足正态分布和方差齐性的要求，这就造成了用一般的回归方法研究上述关系的困难[20]。在这里就需要用到比例风险回归模型（Cox回归模型），该模型是由英国统计学家D.R.Cox于1972年提出的一种半参数回归模型。模型可以用来描述了不随时间变化的多个特征对于在某一时刻死亡率的影响,模型的基本形式如下：h(t,X)=h0(t)exp(β1X1+β2X2+…+βmXm)（公式3-1）其中，β1,β2,…,βm为自变量的偏回归系数，它是须从样本数据作出估计的参数；h0(t)是当X向量为0时，h(t,X)的基准危险率，它是有待于从样本数据作出估计的量。3.4富集分析在这里使用R中的clusterProfiler包对在儿童骨肉瘤发生过程中具有预后作用的lncRNAs与筛选后的17987个蛋白编码基因进行GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGeneandGenomes）通路分析来进一步研究与儿童骨肉瘤患者生存显著相关的lncRNAs的生物学功能。GO功能富集分析和KEGG通路分析在相关系数p<0.05的前提下进行。

第4章实验结果与讨论4.1确定生存相关lncRNA通过将86个来自于TARGET数据库的儿童骨肉瘤患者数据随机分为训练集（n=43）和测试集（n=43）。针对训练集，使用单因素Cox回归模型对数据中包含的所有lncRNAs的单个表达值与患者的生存状况进行分析。最后，选取了18个与儿童骨肉瘤患者预后相关的lncRNAs（p值<0.04；表4-1）。按照风险比（Hazard.Ratio）对这18个lncRNAs进行分析（大于1表示与事件概率正相关的协变量，因此与生存期长度负相关，HR=1：无效；HR<1：减少危害；HR>1：危险增加），发现有9个lncRNAs（ELFN1_AS1、UNC5B_AS1、IGF2BP2_AS1、AC083900.1、PARD6G_AS1、RP11_472M19.2、RP11_597M12.2、CTC_215O4.4、RP11_549L6.3）呈正相关，即这9个基因的表达量越高，对应的儿童骨肉瘤患者的生存期就越短。剩下的9个lncRNAs（RP11_679B19.1、CTD_2269F5.1、RP11_467L19.16、CTD_2341M24.1、RP11_774O3.3、RP11_70D24.2、ACTN1_AS1、RP1_30M3.5、RP11_84G21.1）呈负相关，即这9个基因在生存期较长的儿童骨肉瘤患者中有较高的表达。表4-1与生存相关的18个lncRNA的信息基因编号基因名称风险比CI95P.valueENSG00000236081ELFN1_AS11.491.15-1.930.002669ENSG00000237512UNC5B_AS11.471.03-2.090.03332ENSG00000277954RP11_679B19.10.620.41-0.950.027777ENSG00000163915IGF2BP2_AS11.621.13-2.310.008218ENSG00000250320CTD_2269F1-0.870.007192ENSG00000225111AC083908-3.590.001103ENSG00000278626RP11_467L19.160.490.27-0.880.016884ENSG00000258733CTD_2341M24.10.550.39-0.770.000609ENSG00000267270PARD6G_AS11.671.08-2.570.019897ENSG00000251615RP11_774O3.30.510.3-0.850.009831ENSG00000231441RP11_472M-4.80.005834ENSG00000277621RP11_597M12.21.611.05-2.460.028892ENSG00000278058RP11_70D24.20.550.32-0.970.037669ENSG00000259062ACTN1_AS10.460.23-0.890.021524ENSG00000266936CTC_215O5-40.016766ENSG00000272345RP1_30M3.50.270.13-0.560.000434ENSG00000228417RP11_549L6.32.891.38-6.080.004998ENSG00000257557RP11_84G21.10.350.18-0.690.0022274.2构建生存模型为了在训练集中构建儿童骨肉瘤患者预后分析模型，首先对这18个具有预后作用的lncRNA进行了多因素Cox回归分析，经过多轮迭代多因素Cox回归分析，鉴定出了2个与儿童骨肉瘤患者总体存活率显著相关的lncRNA（表4-2）。表4-2与生存显著相关的2个lncRNA的信息基因编号基因名称coefexp(coef)se(coef)zPr(>|z|)ENSG00000266936CTC_215O4.40.73342.08210.32082.2860.02224ENSG00000231441RP11_472M19.20.92582.52380.34822.6590.00784基于这2个预后lncRNA的表达数据和由多因素Cox回归分析产生的预后lncRNA的回归系数构建儿童骨肉瘤生存预测的风险值评分公式。公式如下：Riskscore=lncRNA1×coef1+lncRNA2×coef2公式（4-1）其中风险值由这2个lncRNA的表达量与多因素多因素Cox回归分析产生的预后lncRNA的回归系数coef乘积之和计算。根据由这2个lncRNA构建的儿童骨肉瘤预后分析模型，计算训练集中的每位患者的风险值，然后根据风险值大小按顺序进行排列。由风险中位数作为阈值，将训练集中的43位患者分为高风险组（n=16）和低风险组（n=27）两组并用Kaplan-Meier曲线（图4-1）展示这2个组的患者的生存状态。Kaplan-Meier生存分析表明高风险组患者与低风险组患者的生存状况存在非常显著差异（p值<0.0001）。低风险患者的生存时间明显比高风险组患者长。低风险组中患者1000、2000、3000天的总体生存率分别为59%、41%、19%；而高风险组中患者在1000、2000、3000天的总体生存率分别为31%、6%、0%。为了评估由这两个2个预后lncRNA建立的儿童骨肉瘤生存模型的性能，对模型进行ROC（ReceiverOperatingCharacteristic）曲线分析，得到该模型的AUC值为0.796（图4-2），进一步说明本次构建的预后分析模型在预测儿童骨肉瘤患者2500天内的生存时间比较准确。图4-1利用生存模型预测训练集中患者的总体生存状况图4-2ROC特征曲线展示模型在训练集中的表现4.3模型整体验证基于儿童骨肉瘤患者生存相关的lncRNAs的生存分析模型在训练集中有较好的表现，为了进一步验证该生存模型的表现，使用类似的方法在测试集中进行测试。计算测试集中的每位患者的风险值，然后根据风险值大小按顺序进行排列。由风险中位数作为阈值，将测试集中的43位患者分为高风险组（n=18）和低风险组（n=25）两组并用Kaplan-Meier曲线（图4-3）展示这2个组的患者的生存状态。Kaplan-Meier生存分析表明高风险组患者与低风险组患者的生存状况存在显著差异（p值=0.016）。与训练集中相同，低风险患者的生存时间明显比高风险组患者更长。低风险组中患者1000、2000、3000天的总体生存率分别为68%、40%、20%；高风险组中患者1000、2000、3000天的总体生存率分别为56%、6%、0%。在整个数据集中进行验证也得到相似的结果（图4-4），在全部的数据集中，将患者分为高风险组（n=34）和低风险组（n=52），同样高风险组患者的生存期明显较低风险患者短。为了评估由这两个2个预后lncRNA建立的儿童骨肉瘤生存模型的性能，在此也对测试集与整个数据集进行ROC（ReceiverOperatingCharacteristic）曲线分析，得到该模型的AUC值为0.726与0.777。说明了这个生存计算模型在不同的数据集中都有较好的表现。图4-3利用生存模型预测测试集中患者的总体生存状况图4-4利用生存模型预测整个数据集中患者的总体生存状况4.4模型独立性验证为了验证构建的生存分析模型对儿童骨肉瘤患者的生存分析的独立性，在这里对整个数据集按照性别进行分组。整个数据集的儿童骨肉瘤患者被分为男性组（n=47）以及女性组（n=39）,将这两个数据集分别用构建的生存分析模型进行预后分析，发现该生存模型依旧能将男性组与女性组的患者划分为高风险和低风险两种类别，且具有较显著的差异（图4-5，p值=0.0034、图4-6，p值<0.0001）。通过该分析结果可以证明，基于骨肉瘤患者的生存分析模型具有较高的独立性，能够准确地对不同性别患者生存期进行估计。图4-5利用生存模型预测整个男性患者的总体生存状况图4-6利用生存模型预测整个女性患者的总体生存状况4.5富集功能分析上文中通过一系列的分析与验证，发现基于儿童骨肉瘤患者生存相关的lncRNAs建立的生存预测模型具有良好的预后预测的能力。为了进一步弄清楚儿童骨肉瘤患者生存相关的lncRNAs在儿童骨肉瘤发生的过程中发挥什么样的作用，进行了富集功能分析。首先进行筛选工作，针对基因的表达量进行过滤，过滤标准设置为：至少有25%的样本，基因的表达量大于2。筛选后，利用R中的clusterProfiler包（该软件包实现了分析和可视化基因与基因簇的功能概况（GO和KEGG）的方法）对基因进行功能富集分析和结果可视化（图4-7、图4-8、图4-9、图4-10）。在这里以筛选后显著的hsa04910通路为例进行KEGG通道富集可视化分析，并在pathway通路图上标记富集到的基因（图4-11）。通过以上的分析，可以发现在各个过程显著的基因，从而研究具有预后价值lncRNA的蛋白编码基因在癌症中起的作用。图4-7GO功能富集分析生物过程柱状图与点状图图4-8GO功能富集分析细胞组成柱状图与点状图图4-9GO功能富集分析分子功能柱状图与点状图图4-10GO功能富集分析有向无环图图4-11KEGG通道富集可视化分析（以hsa04910通路为例）4.6讨论lncRNA在肿瘤的产生与发展中起着重要的作用，其能通过调控重要的癌基因或抑癌基因，进而参与细胞的恶化和肿瘤的发生[21]。许多研究表明lncRNA的异常表达可以作为诊断和预后的独立生物标志物，进而判断病人是否患癌症[22-24]。近年来，有许多研究针对其他预后相关的lncRNA进行分析研究，从而建立起相应癌症的预后预测模型对患者进行预后预测[3,6,7,8]，对患者的临床决策提供了有效的支持，但是尚未有研究对儿童骨肉瘤建立相应的预后预测模型进行预后预测与决策支持。因此，建立有效的风险预测模型对儿童骨肉瘤患者的临床决策具有重要作用。本章对儿童骨肉瘤患者的临床数据和匹配的lncRNA的表达数据进行分析，发现了与儿童骨肉瘤预后相关的2个lncRNA，经过验证，发现基于这2个预后lncRNA建立的风险值预测模型可以有效地分析儿童骨肉瘤患者的预后情况。通过ROC曲线分析，其预后分析的性能是可靠的，所以基于这2个lncRNA建立的风险预测模型可以有效地分析儿童骨肉瘤患者的预后情况。同时，经过模型的独立性验证，通过分析得到的预后相关的lncRNA能够独立于其他临床数据（如性别等）发挥作用。

结语通过从TARGET数据库下载的儿童骨肉瘤患者的临床数据和lncRNA的表达数据进行分析，确定了2个与儿童骨肉瘤患者预后相关的lncRNA，基于这2个lncRNA建立的风险预测模型可以有效地对儿童骨肉瘤患者的生存时间进行估算。通过对转录组数据和儿童骨肉瘤患者的临床数据结合进行分析，更加深入的了解到lncRNA的差异表达与癌症患者生存之间的关系，通过该过程建立的风险预测模型能够得到充分的统计学分析结果的支持。论文研究还有以下不足和改进之处。首先，本文所使用的来自TARGET数据库的儿童骨肉瘤患者的转录组数据和临床数据，如果能使用其他数据平台的儿童骨肉瘤患者的转录组数据和临床数据进行多重验证可以使分析结果更为准确。其次，本次数据的样本数量较少，可用的只有86例儿童骨肉瘤患者的转录组数据和临床数据，过少的样本数量构建的风险预测模型在实际应用中可能会遇到分析的结果不如在全部数据集中测试的准确。最后，对于本次研究使用的转录组数据和临床数据如果进行验证，可以使本次研究的结果更加准确。

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附录：一、合并临床信息和表达量信息代码：clin<-clin[clin$bcr_patient_barcode%in%datExpr$bcr_patient_barcode,]exprSet<-merge(clin,datExpr,by.x="bcr_patient_barcode",by.y="bcr_patient_barcode")二、单因素cox分析代码：Unicox<-function(x){fml<-as.formula(paste0('mysurv~',x))gcox<-coxph(fml,train)cox_sum<-summary(gcox)HR<-round(cox_sum$coefficients[,2],2)PValue<-round(cox_sum$coefficients[,5],6)CI<-paste0(round(cox_sum$[,3:4],2),collapse='-')Uni_cox<-data.frame('Characteristics'=x,'HazardRatio'=HR,'CI95'=CI,'Pvalue'=PValue)return(Uni_cox)}test_var=colnames(train)[4]Unicox(test_var)三、多因素cox分析代码：multi_var<-paste0(sign_rbsurv_gene_names,collapse='+')fml<-as.formula(paste0('mysurv~',multi_var))Multi_cox<-coxph(fml,data=train)Multi_sum<-summary(Multi_cox)Multi_sumMulti_name<-as.character(sign_rbsurv_gene_names)MHR<-round(Multi_sum$coefficients[,2],2)MPValue<-round(Multi_sum$coefficients[,5],3)MCIL<-round(Multi_sum$[,3],2)MCIU<-round(Multi_sum$[,4],2)MCI<-paste0(MCIL,'-',MCIU)Multi_vars<-data.frame('Characteristics'=Multi_name,'HazardRatio'=MHR,'CI95'=MCI,'Pvalue'=MPValue)

致谢时间如白驹过隙般，一晃而过。弹指一挥间，大学四年的美好时光就要结束了。在这四年的时间里，我学到了很多，也收获了很多。在我完成这篇论文的时候，心中众多情绪萦绕心头，久久不能平静。在这里首先对我的论文指导老师房晓南老师表示诚挚的感谢，您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围。在我论文写作期间，即便是工作再忙，房老师您总能挤出时间针对我提出的问题给予细致耐心的解答，最终使得我的论文内容日益丰满进一步得到完善。没有房老师的悉心指导，这篇论文是不可能完成的。同时，我还要感谢我的父母，特别是这段新冠肺炎疫情期间，和家人的相处时间变长，互相了解的更多，更能体会到父母供我求学道路上的种种不易，养育之恩，无法回报，我唯有不断地前进才能不辜负父母的期待。本篇论文也得到了同学与朋友们的帮助，你们无论是生活上还是学习上对我的帮助让我现在仍然历历在目，谢谢你们！

电脑不启动故障诊治了解电脑启动的过程在诸多电脑故障中，无法正常启动是最令用户头痛的事了。笔者长期从事维护电脑的工作，在这个方面积累了一些经验，现在就将这些经验整理归纳出来与朋友们分享。本文将以家用电脑和windows98操作系统为基础，介绍电脑无法正常启动故障的诊治。要想准确地诊断电脑不启动故障，首先要了解的起动过程，当我们按下电源开关时，电源就开始向主板和其它设备供电，此时电压还没有完全稳定，主板控制芯片组会根据CMOS中的CPU主频设置向CPU发出一个Reset(重置)信号，让CPU初始化，电压完全稳定后，芯片组会撤去Reset信号，CPU马上从地址FFFF0H处执行一条跳转指令，跳到系统BIOS中真正的启动代码处。系统BIOS首先要做的事情就是进行POST(PowerOnSelfTest，加电自检)。POST的主要任务是检测系统中的一些关键设备(电源、CPU芯片、BIOS芯片、定时器芯片、数据收发逻辑电路、DMA控制器、中断控制器以及基本的64K内存和内存刷新电路等)是否存在和能否正常工作，如内存和显卡等。自检通过后，系统BIOS将查找显示卡的BIOS，由显卡BIOS来完成显示卡的初始化，显示器开始有显示，自此，系统就具备了最基本的运行条件，可以对主板上的其它部分进行诊断和测试，再发现故障时，屏幕上会有提示，但一般不死机，接着系统BIOS将检测CPU的类型和工作频率，然后开始测试主机所有的内存容量，内存测试通过之后，系统BIOS将开始检测系统中安装的一些标准硬件设备，这些设备包括：硬盘、CD－ROM、软驱、串行接口和并行接口等连接的设备，大多数新版本的系统BIOS在这一过程中还要自动检测和设置内存的相关参数、硬盘参数和访问模式等。标准设备检测完毕后，系统BIOS内部的支持即插即用的代码将开始检测和配置系统中已安装的即插即用设备。每找到一个设备之后，系统BIOS都会在屏幕上显示出设备的名称和型号等信息，同时为该设备分配中断、DMA通道和I/O端口等资源。最后系统BIOS将更新ESCD(ExtendedSystemConfigurationData，扩展系统配置数据)。ESCD数据更新完毕后，系统BIOS的启动代码将进行它的最后一项工作，即根据用户指定的启动顺序从软盘、硬盘或光驱启动。以从C盘启动为例，系统BIOS将读取并执行硬盘上的主引导记录，主引导记录接着从分区表中找到第一个活动分区，然后读取并执行这个活动分区的分区引导记录，而分区引导记录将负责读取并执行IO.SYS，这是Windows最基本的系统文件。IO.SYS首先要初始化一些重要的系统数据，然后就显示出我们熟悉的蓝天白云，在这幅画面之下，Windows将继续进行DOS部分和GUI(图形用户界面)部分的引导和初始化工作，一切顺利结束，电脑正常启动。根据故障现象诊治了解电脑启动的过程，故障就好判断了，下面我们就根据故障现象开始诊治了：现象一：系统完全不能启动，见不到电源指示灯亮，也听不到冷却风扇的声音。这时，基本可以认定是电源部分故障，检查：电源线和插座是否有电、主板电源插头是否连好，UPS是否正常供电，再确认电源是否有故障，最简单的就是替换法，但一般用户家中不可能备有电源等备件，这时可以尝试使用下面的方法（注意：要慎重）：先把硬盘，CPU风扇，或者CDROM连好，然后把ATX主板电源插头用一根导线连接两个插脚（把插头的一侧突起对着自己，上层插脚从左数第4个和下层插脚从右数第3个，方向一定要正确），然后把ATX电源的开关打开，如果电源风扇转动，说明电源正常，否则电源损坏。如果电源没问题直接短接主板上电源开关的跳线，如果正常，说明机箱面板的电源开关损坏。现象二：电源批示灯亮，风扇转，但没有明显的系统动作。这种情况如果出现在新组装电脑上应该首先检查CPU是否插牢或更换CPU，而正在使用的电脑的CPU损坏的情况比较少见（人为损坏除外），损坏时一般多带有焦糊味，如果刚刚升级了BIOS或者遭遇了CIH病毒攻击，这要考虑BIOS损坏问题（BIOS莫名其妙的损坏也是有的），修复BIOS的方法很多杂志都介绍过就不重复了；确认CPU和BIOS没问题后，就要考虑CMOS设置问题，如果CPU主频设置不正确也会出现这种故障，解决方法就是将CMOS信息清除，既要将CMOS放电，一般主板上都有一个CMOS放电的跳线，如果找不到这个跳线可以将CMOS电池取下来，放电时间不要低于5分钟，然后将跳线恢复原状或重新安装好电池即可；如果CPU、BIOS和CMOS都没问题还要考虑电源问题：PC机电源有一个特殊的输出信号，称为POWERGOOD（PG）信号，如果PG信号的低电平持续时间不够或没有低电平时间，PC机将无法启动。如果PG信号一直为低电平，则PC机系统始终处于复位状态。这时PC机也出现黑屏、无声响等死机现象。但这需要专业的维修工具外加一些维修经验，因此，建议采用替换法；电源没有问题就要检查是否有短路，确保主板表面不和金属（特别是机箱的安装固定点）接触。把主板和电源拿出机箱，放在绝缘体表面，如果能启动，说明主板有短路现象；如果还是不能启动则要考虑主板问题，主板故障较为复杂，可以使用替换法确认，然后更换主板。现象三：电源指示灯亮，系统能启动，但系统在初始化时停住了，而且可以听到嗽叭的鸣叫声（没有视频）：根据峰鸣代码可以判断出故障的部位。ccid_page/AwardBIOS1短声：说明系统正常启动。表明机器没有问题。2短声：说明CMOS设置错误，重新设置不正确选项。1长1短：说明内存或主板出错，换一个内存条试试。1长2短：说明显示器或显示卡存在错误。检查显卡和显示器插头等部位是否接触良好或用替换法确定显卡和显示器是否损坏。1长3短：说明键盘控制器错误，应检查主板。1长9短：说明主板FlashRAM、EPROM错误或BIOS损坏，更换FlashRAM。重复短响：说明主板电源有问题。不间断的长声：说明系统检测到内存条有问题，重新安装内存条或更换新内存条重试。AMIBIOS1短：说明内存刷新失败。更换内存条。2短：说明内存ECC较验错误。在CMOS中将内存ECC校验的选项设为Disabled或更换内存。3短：说明系统基本内存检查失败。换内存。4短：说明系统时钟出错。更换芯片或CMOS电池。5短：说明CPU出现错误。检查CPU是否插好。6短：说明键盘控制器错误。应检查主板。7短：说明系统实模式错误，不能切换到保护模式。8短：说明显示内存错误。显示内存有问题，更换显卡试试。9短：说明BIOS芯片检验和错误。1长3短：说明内存错误。内存损坏，更换。1长8短：说明显示测试错误。显示器数据线没插好或显示卡没插牢。现象四：系统能启动，有视频，出现故障提示，这时可以根据提示来判断故障部位。下面就是一些常见的故障提示的判断：一、提示“CMOSBatteryStateLow”原因：CMOS参数丢失，有时可以启动，使用一段时间后死机，这种现象大多是CMOS供电不足引起的。对于不同的CMOS供电方式，采取不同的措施：1.焊接式电池：用电烙铁重新焊上一颗新电池即可；2.钮扣式电池：直接更换；3.芯片式：更换此芯片，最好采用相同型号芯片替换。如果更换电池后时间不长又出现同样现象的话，很可能是主板漏电，可检查主板上的二极管或电容是否损坏，也可以跳线使用外接电池，不过这些都需要有一定的硬件维修基础才能完成。二、提示“CMOSChecksumFailure”CMOS中的BIOS检验和读出错；提示“CMOSSystemOptionNotSet”，CMOS系统未设置；提示“CMOSDisplayTypeMismatch”，CMOS中显示类型的设置与实测不一致；提示“CMOSMemorySizeMismatch”，主板上的主存储器与CMOS中设置的不一样；提示“CMOSTime&DateNotSet”，CMOS中的时间和日期没有设置。这些都需要对CMOS重新设置。三、提示“KeyboardInterfaceError”后死机原因：主板上键盘接口不能使用，拔下键盘，重新插入后又能正常启动系统，使用一段时间后键盘无反应，这种现象主要是多次拔插键盘引起主板键盘接口松动，拆下主板用电烙铁重新焊接好即可；也可能是带电拔插键盘，引起主板上一个保险电阻断了（在主板上标记为Fn的东西），换上一个1欧姆／0.5瓦的电阻即可。四、自检过程中断在xxxKCache处这表示主板上Cache损坏，可以在CMOS设置中将“ExternalCache”项设为“Disable”故障即可排除。同理，在自检主板部件时出现中断，则可以认为该部件损坏，解决方法一般可以在CMOS中将其屏蔽，如果不能屏蔽该部件最好更换主板。五、提示“FDDControllerFailure”BIOS不能与软盘驱动器交换信息；提示“HDDControllerFailure”，BIOS不能与硬盘驱动器交换信息。应检查FDD（HDD）控制卡及电缆。六、提示“8042GateA20Error”8042芯片坏；提示“DMAError”，DMA控制器坏。这种故障需要更换。七、提示“DisplaySwitchNotProper”主板上的显示模式跳线设置错误，重新跳线。八、提示“KeyboardisLock...Unlockit”键盘被锁住，打开锁后重新引导系统。九、IDE接口设备检测信息为：“DetectingPrimary（或Secondary）Master（或Slave）...None”表示该IDE接口都没有找到硬盘，如果该IDE口确实接有硬盘的话，则说明硬盘没接上或硬盘有故障，可以从以下几方面检查：1、硬盘电源线和数据线是否接触不良，或换一根线试试；2、CMOS设置有无错误，进入CMOS将“PrimaryMaster”、“PrimarySlave”、“SecondaryMaster”三项的的“TYPE”都设置成“Auto”；3、替换法确认硬盘本身有故障。十、IDE接口设备检测信息下面显示“Floppydisk(s)fail(40)”出错信息表示CMOS所指定的软盘驱动器有问题。判断和解决的方法与硬盘相似。现象五：系统不能引导。这种故障一般都不是严重问题，只是系统在找到的用于引导的驱动器中找不到引导文件，比如：BIOS的引导驱动器设置中将软驱排在了硬盘驱动的前面，而软驱中又放有没有引导系统的软盘或者BIOS的引导驱动器设置中将光驱排在了硬盘驱动的前面，而光驱中又放有没有引导系统的光盘，这个都很简单，将光盘或软盘取出就可以了，实际应用中遇到“DiskBootFailure，InsertSystemDiskAndPressEnter”的提示，多数都是这个原因。如果是硬盘不能引导的话一般有两种情况：一种是硬盘数据线没有插好，另一种就是硬盘数据损坏。前者一般多会出现硬盘容量检测不正确和引导时出现死机的现象；后者则是干脆找不到引导文件或提示文件损坏。前者只需重新连接好数据线即可；后者则需要用win98的启动软盘或启动光盘启动，根据实际情况来定：一、提示“Invalidpartitiontable”或“NotFoundany[activ