甾体激素类药物的分析

甾体激素类药物的分析基本结构：环戊烷骈多氢菲ABCD12345678910111213141516171819第一节基本结构与分类：甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素一肾上腺皮质激素天然的皮质激素--氢化可的松醋酸地塞米松醋酸地塞米松为地塞米松C21位上的羟基所形成的醋酸酯，肌注延长时间曲安西龙地塞米松磷酸钠是地塞米松C21位羟基与磷酸成酯后，又成盐，增大脂溶性。一、结构与性质1.肾上腺皮质激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应

C17

–

α–醇酮基还原性21个碳，A环又共扼，17位位有α-醇铜，9α-有F，16α有羟基。二雄性激素与蛋白同化激素丙酸睾酮酯化吸收减慢，作用时间长。17位加甲基作用更强蛋白同化激素苯丙酸诺龙---2.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应

C17–

β–羟基可成酯雄性激素母核有19个碳原子，蛋白同化激素在碳10位上一般无角甲基，18个碳原子。三孕激素黄体酮醋酸甲地孕酮三.孕激素主要活性基团性质△4–3–酮UV、与羰基试剂反应C17–甲酮基与亚硝基铁氰化钠反应C17–乙炔基与AgNO3反应四雌激素炔雌醇炔雌醇雌二醇炔雌酮炔诺孕酮四.雌激素主要活性基团性质A环为3–OH苯环UV、与重氮苯磺酸盐反应C17–乙炔基与AgNO3反应C17–羟基可成酯第二节鉴别试验一化学鉴别法（一）与强酸的呈色反应母核的反应，机制不明。甾体激素类药物呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl与硫酸显色反应显色荧光加水稀释泼尼松龙深红絮状↓灰泼尼松橙黄→蓝绿炔雌醚橙红黄绿↓红色

炔雌醇橙红黄绿絮状↓玫红醋酸可的松黄或微褪色并澄带橙清与硫酸成色操作简便，依颜色与荧光可区别，反应灵敏，为各国药典所用。如中国药典：氢化可的松，2mg，硫酸2mg溶解，5分钟后现棕黄至红，并显绿色荧光，此液倾入10ml水中，变黄色至橙黄，有少量絮状沉淀生成。(二)官能团的反应肾上腺皮质激素药物呈色四氮唑盐OHˉ1C17

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α–醇酮基还原性A.呈色反应例如中国药典中醋酸泼尼松的鉴别方法：本品1mg，加乙醇2ml溶解，10%2滴。氯化三苯四氮唑试液1ml，显红色。肾上腺皮质激素药物Cu2O↓橙红色碱性酒石酸铜B.酮基沉淀反应Ag↓黑色氨制硝酸银多伦试剂斐林试剂甾酮类激素药物呈色羰基试剂2.C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼异烟腙（黄色）睾酮黄体酮异烟双腙（黄色）

例如黄体酮的鉴别：取供试品0.5mg，与小试管中，加异烟肼1mg，甲醇1mg溶解，显黄色。具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物呈色亚硝基铁氰化钠间二硝基酚芳香醛3.甲酮基的成色反应黄体酮蓝紫色亚硝基铁氰化钠其他甾体淡橙色不显色亚硝基铁氰化钠是黄体酮专属而灵敏的反应黄体酮蓝紫色雌激素类药物红色偶氮染料重氮苯磺酸4.酚羟基的成色反应含炔基的甾体激素银盐沉淀硝酸银5.乙炔基的沉淀反应↓炔雌醇白有机氟Fˉ有机破坏有机氯Clˉ6.有机卤素的反应茜素氟蓝硝酸亚铈硝酸—硝酸银AgCl↓呈色茜素氟蓝蓝紫色F-铈

药典规定地噻米松磷酸钠用氧瓶燃烧法处理，在pH4.3条件下与硝酸亚铈反应成蓝紫。脂肪链上的氯可水解脱落。中国药典规定氯倍他索，取少许，加乙醇加热，加硝酸2ml，加硝酸银数滴，成白色沉淀。氯在母核上（丙酸倍氯米松）不易脱落，要用氧瓶燃烧法处理。香7酯的反应特臭特臭不少药物是C17或C21上羟基的酯类。可根据羧酸的性质来鉴别，如是醋酸酯可用上述方法鉴别。△二制备衍生物测定m.p.繁琐，但专属性强（一）羰基和氨基缩合后再测熔点，苯丙酸诺龙的鉴别方法：取本品50mg，加甲醇2ml溶解。加盐酸氨基脲，4ml，加热回流，30min，水浴浓缩，过滤，洗，干燥。M.p.182℃。△（二）酯的水解△（三）其他羰基与羟胺成肟KOH羟基与酰氯成酯△４-3-酮240nm苯环280nm（三）UV法4–3酮型1，4–3酮型1，6–3酮型

用最大吸收波长的吸光度的绝对值或两波长吸光度之比值进行鉴别。如中国药典规定：丙酸倍氯米松的乙醇液（20ug/ml）在239nm处的最大吸收为0.57-0.60。239与263之比值为2.25-2.45。3300～3000cm-13000～2700cm-11900～1650cm-11650～1450cm-11000～650cm-1（三）IR法3750～3300cm-1ν结构特征：酚羟基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇1505cm-1ν3505cm-3300cm-1ν1590cm-13610cm-ν酚羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动醋酸可的松结构特征：△4–3–酮、C17–OHC20–酮基、C11–酮基、醋酸酯1630cm-1ν3420cm-亚甲基、角甲基吸收带1750cm-11232cm-11052cm-1结构特征：△4–3–酮、C17–OHC17–乙炔基炔孕酮1650cm-1ν3300cm-3270cm-1ν1615cm-1五TLC法

主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别方法：对照品法要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。炔诺酮TLC图六HPLC法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）方法：对照品法要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。第三节、杂质检查（一）其他甾体定义与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”特点（1）可能存在多个甾体杂质（2）结构类似2.来源原料、中间体、异构体、降解产物4.方法（具有一定分离能力）TLC法（高低浓度对比法）HPLC法（类似高低浓度对比法）（一）TLC法（高低浓度对比法）判定方法：规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色氢化可的松检查其他甾体

取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶G板上，展开后晾干，在105℃干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。12特点：（1）简便易行，不需特殊的仪器；（2）需对照品；（3）只能控制单个杂质的限量；（4）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。（二）HPLC法（高低浓度对比法）判定方法：规定杂质峰数目规定杂质峰面积

取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成每1ml含1mg的溶液（1）与每1ml含0.02mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液，取5μl注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）黄体酮检查其他甾体和溶液（2）各10μl，进样。记录至主成分峰保留时间的1.5倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过1个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的3/4。供试溶液：溶液（1）1mg/ml对照溶液：溶液（2）0.02mg/ml特点：（1）需特殊的仪器；（2）不需对照品；（3）可以控制杂质的总量；

硒的检查来源合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢剧毒方法醋酸氟轻松检查硒

取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05ug/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.00.2后，转移至分液漏斗中，用水少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（1→2）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基奈试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2′，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。规定A供＜A对。（三）有机溶剂残留量检查-甲醇和丙酮（灵敏度法）甲醇不得出峰检测限=3.1ng丙酮≤5.0%内标法+校正因子GC法地塞米松磷酸钠检查甲醇和丙酮精密量取甲醇10μl(≈7.9mg)与丙酮100μl(≈79mg)置100ml量瓶中，精密加内标溶液20ml，加水至刻度，作为对照液。精密称取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密加内标溶液2ml，加水稀释至刻度，作为供试液；照气相色谱法测定，含丙酮不得过5.0%，并不得出现甲醇峰。四游离磷酸盐对照品法地塞米松磷酸钠氢化可的松磷酸钠倍他米松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠原理：方法：地塞米松磷酸钠检查游离磷酸精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放置30～50分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法处理的吸收度比较，不得更大。（对照液0.0035%KH2PO4）第四节、含量测定（一）HPLC法USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多内标法）（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）特点用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快。二UV法△４-3-酮240nm（±）肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯环280nm（±）雌激素一、炔孕酮的含量测定取本品，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml约含10µg的溶液,照分光光度法，在240nm的波处测定吸光度，按炔孕酮的吸收系数为390计算，即得。本法以无水乙醇为溶剂配制供试品溶液。在最大吸收波长240nm处测定吸收度后，按已知的吸收系数计算含量，即采用吸收系数法计算2.醋酸地塞米松片的含量测定醋酸地塞米松在240nm处有最大吸收（见图10-5），中国药典采用紫外分光光度法测定醋酸地塞米松片的含量‘·取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于醋酸地塞米松不5哪），置沐叩叫量瓶中，加乙攀7侧，箕SQ戈一60弋的水攀冲保温l0min，并时时振摇使醋酸地塞米松溶解，放冷至室温，加乙醉稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液劲汕，置势二，加耐量瓶中，加艺薛室刻度，摇匀，吞240nm的波长处测定吸收度，按C24H31拍‘韵瞬雌不数（武篡）为357计算，三比色法（一）异烟肼比色法1原理：C3－酮基和某些位置上的酮基能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合HCl（缩合）异烟腙（黄色）2.方法对照品法暗45′醋酸地塞米松软膏含量测定对照液：精密称取醋酸地塞米松对照品25mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，用无水乙醇稀释至50ml，摇匀。供试液：精密称取本品适量（约相当于醋酸地塞米松25mg），置烧杯中，加无水乙醇约25ml，置水浴中加热，搅拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定法：精密量取上述溶液各10ml，分别置具塞容器中，置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿10ml，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%异烟肼甲醇溶液10ml，摇匀，置55℃暗处保温45分钟，取出，放冷，用氯仿稀释至25ml。摇匀，在415nm的波长处分别测定吸收度，计算即得。3.讨论（1）溶剂的选择异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇无水甲醇无水乙醇酸、异烟肼的量(2)盐酸:异烟肼=2:1样品:异烟肼=1:8→ν↑酸度↑→异烟肼盐↓酸度↓→A↓t℃↑→ν↑（3）水分、温度、O2与光线的影响含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不挥发溶剂、不吸收水分时→O2与光线无影响（4）关于反应的专属性反应速度C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反应对C3－酮基最敏感。三苯甲瓒↓深红（二）四氮唑比色法1种类氯化三苯四氮唑（TTC）红四氮唑（RT）蓝四氮唑（BT）双甲瓒（暗蓝）

OH-[还原]2原理肾上腺皮质激素类药物的含量测定方法。C17-α－醇酮基，具强还原性，四氮唑盐成有色的甲瓒。[O]OH-分子重排反应机制醋酸泼尼松龙软膏含量测定对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。3.方法对照品法供试液：精密称取本品4g（约相当于醋酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定法：精密量取上述溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃暗处放置40～50分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。操作应避光。4.讨论（1）基团对反应速度的影响C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯C16无论何种取代基ν↓（2）溶剂、水分的影响含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→几无反应—无醛无水乙醇醛→A↑—无水乙醇（3）碱的种类及加入顺序反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行以氢氧化四甲基铵的结果最佳加入顺序：（4）O2与光线的影响反应过程反应产物怕光→避光、快速O2影响颜色强度和稳定性→隔绝空气、快速、充N2（5）温度与时间t℃↑→ν↑→甲瓒分解↑→%↓ChP25℃40～45′BP30℃1h4.特点：缺点影响因素太多优点测定结果能指示药品的稳定性（氧化及降解产物无此反应）λmax=465λmax=5151.原理雌激素与硫酸乙醇反应呈色（三）Kober反应比色法△△2.特点：优点较高的灵敏度具有一定的选择性缺点非化学计量反应反应控制条件、注意平行原则1、熟悉本类药物的分类，掌握其结构特征与分析方法的关系2、掌握红外光谱鉴别法及某些官能团的呈色反应，了解其他鉴别方法3、掌握本类药物中其他甾体的检查方法，了解其他特殊杂质的检查第十章复习内容4、掌握四氮唑比色法、异烟肼比色法的原理、方法及测定条件。了解UV法、Kober反应比色法及HPLC法在其含量测定中的应用参考习题甾体激素类药物的结构中能和四氮唑盐发生显色反应的基团A.酚羟基B.活泼次甲基C.甲酮基D.C17-α-醇酮基E.酮基用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是A．强酸性B．中性C．强碱性D．弱碱性E．以上都不对A．维生素B1B．醋酸地塞米松C．两者皆是D．两者皆不是31.异烟肼比色法32.硫色素反应33.紫外分光光度法34.羟肟酸铁反应35.绿奎宁（Thaciaquin）反应BACDD可用于氢化可的松鉴别的试剂有A．氨制硝酸银B．异烟肼C．红四氮唑D．硫酸E．重氮苯磺酸可用于甾体激体类药物的测定方法有A．高效液相色谱法B．四氮唑盐法C．紫外分光光度法D．异烟肼比色法E．Kober反应比色法能与亚硝基铁氰化钠反应生成兰紫色的药物是A．雌二醇B．黄体酮C．醋酸可的松D．苯丙酸诺龙E．以上都不对各国药典对甾体激素类药物常用HPLC或GC法测定其含量，主要原因是A.它们没有特征紫外吸收，不能用紫外分光光度法B.不能用滴定分析法进行测定C.由于“其它甾体”的存在，色谱法可消除它们的干扰D.色谱法比较简单，精密度好E.色谱法准确度优于滴定分析法异烟肼比色法测定甾体激素类药物时，药物的呈色基团是A.酮基B.酚羟基C.活泼次甲基D.炔基E.甾体母核四氮唑比色法可用于下列哪个药物的含量测定A.可的松B.睾丸素C.雌二醇D.炔雌醇E.黄体酮可适用的药物：A.可的松B.雌二醇C.两者均可D.两者均不可亚硝酸钠滴定法高效液相色谱法能与羰基试剂缩合可用铁酚试剂比色法测定可用四氮唑比色法测定DCABAKober反应是A.雌性激素与硫酸乙醇共热呈色B.皮质激素与硫酸一乙醇共热呈色C.雌性激素与硫酸－乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后加热颜色改变D.维生素A与无水三氯化锑的无醇氯仿溶液呈色E.异丙嗪于酸性条件下与钯离子呈色黄体酮在酸性溶液中可与下列哪些试剂反应呈色A.2,4-二硝基苯肼B.三氯化铁C.硫酸苯肼D.异烟肼E.四氮唑盐Kober反应适用于哪一药物的含量测定A.黄体酮B.雌二醇C.甲基睾丸素D.甲基炔诺酮