酶的分离纯化

关于酶的分离纯化一、概述1.工业上应用的酶制剂：纯度不高，如工业上用于织物退浆的α-淀粉酶纯度不高;用于皮革工业和食品工业的蛋白酶，其纯度和质量要求也不高；2.食品工业中用的酶制剂：如α-淀粉酶纯度较高；分离纯化要根据使用目的进行。

第2页,共120页，2024年2月25日，星期天酶分离纯化包括三个基本环节：其一抽提，把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；其二纯化，把杂质从酶溶液中除掉或把酶从酶溶液中分离出来；其三制剂，即是将酶制成各种剂型。第3页,共120页，2024年2月25日，星期天分离纯化应注意以下问题分离纯化过程中必须注意的问题：（1）防止酶的变性失活：大多数酶在pH﹤4或﹥10的条件下不稳定；应防止酶溶液形成泡沫避免酶失活；重金属要引起酶失活，避免接触；有机溶剂能使酶变性；防止微生物污染、蛋白酶也使酶变性；操作应在低温下进行。（2）酶的分离纯化的目的：是将酶从酶溶液中分离出来，因此，在不破坏酶活性的条件下，可使用各种方法。（3）从原料开始每步都必须检测酶活性，一个好的方法使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。第4页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白酶的纯化结果纯化步骤steps总蛋白量Total

protein(mg)总酶活Tatal

activity(u)比活性Specific

activity(u/mg)纯化倍数Purification

fold收率Recovery(%)发酵液Culture

fluid228770833.811100硫酸铵分级盐析(NH4)2SO4Fraction80.63448656.081.6658.2离子交换层析Anion-exchange

chromatography

on

DEAE-Sephadex

A252.01640.64820.322421.28凝胶过滤层析Gel-filtration

chromatography

on

Sephadex

G751.11064.16967.4228.6113.81第5页,共120页，2024年2月25日，星期天

二、酶活力的测定1.酶的活性测定酶活力（EnzymeActivity）也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。1.1酶的活力单位（EnzymeActivityUnit,U）：酶的活力单位用U来表示。1961年国际酶学委员会曾规定，在特定的条件（25℃、具有最适底物浓度、最适温度、最适pH值和离子强度系统）下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个国际单位（IU）。近来，国际上又用Katal作为酶的标准单位，即在一秒钟内转化1mol底物所需的酶量规定为1个Katal，用Kat（开特）表示。1Kat=1mol/s=60mol/min=60×106µmol/min=6×107IU。第6页,共120页，2024年2月25日，星期天目前酶活力单位状况实际上研究工作中及商品酶制剂中，酶活力单位的定义一直处于混乱中，各自随意制定单位。因此，同一种酶有几种不同的活力单位，或同样的活力单位不一定酶活力是相同的，也不便于比较酶活力，要比较文献报道的酶活力或者不同品牌酶制剂活力大小时，必须注意他们的酶活力定义方法及测定方法系统和条件。第7页,共120页，2024年2月25日，星期天酶活力的表示方法对液体状态的酶活力常以U/ml（酶液）表示。固体酶制剂酶的活力常以U/mg表示。1.1比活力（性）：酶比活力（SpecificActivity）是酶纯度的量度，是指单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU／mg蛋白质表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力越大。比活力

相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。第8页,共120页，2024年2月25日，星期天1.2酶活力的测定方法1.2酶活力的测定方法：酶活力与底物浓度、酶的用量、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。（1）终止反应法（StoppedMethod）

底物＋酶一定时间反应完全停止取出反应物分离再确定反应物的消耗量或产物的形成量算出酶活性。(2)连续反应法:无须终止反应而是在酶反应过程中用光学仪器来监测反应进行情况。第9页,共120页，2024年2月25日，星期天终止反应法1、酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成可用分光光谱法或荧光光谱仪测定的化合物。2、化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出的化合物，可定量地测出反应物，再算出酶活性。如脲酶催化尿素水解反应，产物是NH3和CO2，可用比色法、滴定法、气体体积量度法等检测出酶活性。此法的优点是设备简单，不需特殊仪器，应用较广，但工作量大，对于反应速度较快的酶，时间难于控制。3、分光光度测定法是酶学研究常用的方法。酶反应中的底物或产物往往含有不饱和的或环状的原子团，如－CH＝CH－、＞C＝O、－N＝N－、－C6H5等，他们在可见光区、紫外光区或红外光区具有吸光性，反应底物或产物显示不同吸收光谱，因此，根据光吸收的变化来测定酶反应的进行情况。此法特点是迅速、简便、灵敏和专一性强。放射性化学法是具有放射性的产物测定的方法，根据全放射量，算出产物量，从而计算出酶活。第10页,共120页，2024年2月25日，星期天终止反应的方法：1.反应时间到后，立即取出反应液，沸水处理酶失活。2.加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶失活。3.加入酸或碱溶液，使反应液的pH值远离最适pH值而终止反应。4.取出反应液立即置于冰箱、冰粒堆或冰盐水中，使反应液快速降低在10℃而终止反应，回避最适温度。第11页,共120页，2024年2月25日，星期天1.3酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的问题：(1)底物的浓度:底物纯度、浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和)，否则，底物浓度本身是一个限制因子；底物要新鲜配置。第12页,共120页，2024年2月25日，星期天1.3酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的问题：(2)反应必须在酶的最适条件：如最适温度、pH和离子强度等;(3)测定酶活性所用的试剂中不应含有酶的抑制剂、激活剂；同时底物本身不能有裂解。(4)测定酶活力一定要在反应的初速度状态，酶浓度、底物浓度、反应时间都保证在初速度反应状态才具有代表性。第13页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白酶活力测定原理:1、蛋白酶降解蛋白质呈色反应，如弹性蛋白酶降解地衣红弹性蛋白呈红色;2、酪蛋白＋蛋白酶产生的肽和氨基酸＋遇到三氯醋酸后不再沉淀而是溶解在三氯醋酸中用佛锡二氏指示剂显色，取上清液再用分光光度法测定。此法具有快速和准确的优点。第14页,共120页，2024年2月25日，星期天1、试剂：（1）磷酸盐缓冲液（pH8.0）取3.56克二水磷酸二氢钠溶于740ml蒸馏水中，用1mol/LNaOH溶液将pH调至8.0，定容至1000ml。（2）三氯醋酸溶液：取6.54克三氯醋酸溶于蒸馏水中，定容至100ml。（3）碳酸钠溶液：取21.2克碳酸钠溶于蒸馏水中，定容至500100ml。（4）佛锡二氏指示剂：用4份蒸馏水稀释1份佛锡二氏指示剂。（5）底物溶液：取1.5克酪蛋白（生化试剂）放入30ml0.1mol/LNaOH溶液中，并加热至酪蛋白完全溶解。冷却后用正磷酸（H3PO4用蒸馏水按1：25稀释）将pH调至8.0,用蒸馏水定容至100ml。（6）酶溶液：用磷酸盐缓冲液稀释酶，配制的酶溶液浓度应为0.3U／ml。(7)酪氨酸标准溶液：取25mg酪氨酸溶于o.1mol/L盐酸250ml中，配制成0.1mg/ml再用此盐酸液按1：10稀释。第15页,共120页，2024年2月25日，星期天2、测定程序：用吸液管将1.0ml底物溶液滴入一试管，并置于水浴中调温至37℃。加1.0ml酶溶液，振荡，并按动秒表计时，于37℃精确保温60分钟后加2.0ml三氯醋酸溶液，终止反应。在水浴中再放置25分后过滤此反应液。取出1.0ml上清液与5.0ml碳酸钠溶液和1.0ml佛锡二氏指示剂混合，将此溶液于37℃再静止20分。然后用分光光度计于660nm处的空白值为参比测定吸光度(1cm比色皿)。第16页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白酶的活力测定

单位：ml实验组空白值底物溶液蒸馏水混合，调温至37℃，加酶溶液混合，按动秒表，于37℃精确保温60分；加三氯醋酸于37℃静置25分，过滤，取出1.0ml上清液，加碳酸钠溶液佛锡二氏指示剂于37℃再静置25分后，用分光光度计在660nm处以空白值为参比测定吸光度1.0－1.02.05.01.01.01.0－2.05.01.0定义：在此条件下产生相当于100ug酪氨酸时所需的酶量为一个酶活力单位。第17页,共120页，2024年2月25日，星期天弹性蛋白酶活力的测定方法根据Sacher法并参照我国现行药用弹性蛋白酶测定方法单位ml实验组空白值底物溶液（浓度）蒸馏水混合，调温至37℃,加酶溶液pH7.4,0.2mol/L硼酸混合,37℃保温,计时60分钟,加pH6.0，0.7mol/L磷酸钠终止液静置20分左右过滤,取上清液用分光光度计比色590nm1ml1ml2ml2ml1ml1ml2ml2ml定义：在此条件下降解1mg底物或产生1mg的产物所需的酶量为一个酶活力单位。第18页,共120页，2024年2月25日，星期天酶活力的计算方法标准曲线的测定及绘制以酪氨酸的浓度为横坐标，E660吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。酶活力单位的定义：在此条件下（37℃振荡20分钟）溶解1mg底物或产生1mg的产物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活力单位U。试液号酪氨酸标准溶液量ml(0.1mg/ml)0.1mol/L盐酸/ml酪氨酸溶液ugE660空白1234567－0.10.20.40.50.60.81.010.90.80.60.50.40.2_－102040506080100－0.0920.1730.3210.4200.5020.6680.825第19页,共120页，2024年2月25日，星期天酶活性单位的计算最后酶的活性单位=计算值×酶溶液的稀释倍数第20页,共120页，2024年2月25日，星期天α-淀粉酶活力测定－D60°60'消色法定义：在pH6.0，60℃条件下，每小时催化1g可溶性淀粉成为糊精的酶量为1个酶活力单位。原理：利用碘遇淀粉变蓝检验淀粉转化为糊精。方法：试剂如下：（1）碘原液：碘11g，碘化钾22g，定容至500ml。（2）标准稀碘液：碘原液15ml，加碘化钾8g，定容至500ml。（3）比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，定容至500ml。（4）2％可溶性淀粉：称可溶性淀粉2g，用少许蒸馏水混合均匀，再慢慢倾入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸2分钟，冷却后定容至100ml（当天配制使用）。（5）pH6.0磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O称取45.23g，柠檬酸8.07g，加蒸馏水定容至1000ml。（6）标准糊精液：称取分析纯糊精0.3g，用少许蒸馏水混均后倾入400ml水中，冷却后定容至500ml，加几滴甲苯防腐，冰箱保存。第21页,共120页，2024年2月25日，星期天

操作方法1、取1ml标准糊精液，置于盛有3ml标准碘液的试管中，作为比较颜色的标准管。（或吸取2ml置于白色瓷板的空穴内，作为比色标准）2、在25×200mm试管中，加入2％可溶性淀粉液20ml，加缓冲液5ml，在60℃水浴中平衡约5分钟，加入0.5ml酶液，立即计时并充分混匀，定时取出1ml反应液于预先盛有比色稀碘液的试管内，或取出0.5ml于预先盛有比色稀碘液的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙（红）色，与标准色相同时，即为反应终止点，记录时间。反应时间控制在2～2.5分内；测定照明用40W日光灯，灯与瓷板的间距应为60厘米左右为宜；白瓷板可用10ml比色管代替。3、计算：α-淀粉酶活力＝(60/t×20×2％×n)÷0.5(单位/ml)t－反应时间（分）n—酶液稀释倍数0.5—使用的酶液量（ml）2％—淀粉浓度20—可溶性淀粉的毫升数

第22页,共120页，2024年2月25日，星期天α-淀粉酶活力测定方法二－D30°60'消色法定义：在pH6.0，30℃条件下，每小时催化1ml2％可溶性淀粉成为糊精的酶量为1个酶活力单位。原理：利用碘遇淀粉变蓝检验淀粉转化为糊精。方法：试剂如下：（1）碘原液：碘11g，碘化钾22g，定容至500ml。（2）pH5.7醋酸缓冲液。（3）比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，定容至500ml。（4）2％可溶性淀粉：称可溶性淀粉2g，用少许蒸馏水混合均匀，再慢慢倾入煮沸的蒸馏水中，继续煮沸2分钟，冷却后加5mlpH5.7醋酸缓冲液定容至100ml（当天配制使用）。（5）标准比色液：CoCl22·6H2O称取2.5g，重铬酸钾0.384g，以0.01N的HCl定容至100ml。第23页,共120页，2024年2月25日，星期天操作方法1、取20ml2％可溶性淀粉液于试管内，预热5分钟。加入10ml稀释酶液（30℃），混匀，并立即计时，在30℃反应，定时取出0.5ml反应液滴到预先盛有比色稀碘液的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙（红）色，与标准色相同时，即为反应终止点，记录反应时间。反应时间控制在10～60分内；测定照明用40W日光灯，灯与瓷板的间距应为60厘米左右为宜；白瓷板可用10ml比色管代替。3、计算：α-淀粉酶活力＝60/t×20×n(单位/ml)t－反应时间（分）n—酶液稀释倍数第24页,共120页，2024年2月25日，星期天糖化酶活力的测定方法1、定义：以单位时间内生成一定量的葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。但酶反应的条件各不相同，酶活力单位定义也有所差别。2、试剂：（1）0.1mol/L乙酸—乙酸钠缓冲液(pH4.6)，称取6.7g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)，吸取冰醋酸2.6ml，用蒸馏水溶解定容至1000ml，然后以酸度校正pH。（2）0.05mol/LNa2S2O3溶液：按GB601《化学试剂标准溶液制备方法》中2.7执行。（3）0.1mol/LI2液：按GB601《化学试剂标准溶液制备方法》中2.10执行。（4）0.1mol/LNaOH溶液：按GB601《化学试剂标准溶液制备方法》2.2执行。（5）2mol/LH2SO4溶液：取分析纯浓硫酸（相对密度1.84）5.6ml缓缓加入适量蒸馏水中，冷却后用蒸馏水定容至100ml，摇匀。（6）20％NaOH溶液：称取20g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至100ml。（7）2％可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉2g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100ml，此溶液需当天配制。第25页,共120页，2024年2月25日，星期天α-淀粉酶、糖化酶作用的机理α-淀粉酶作用的机理：是内切淀粉酶，能随机水解淀粉，可溶性糊精及低聚糖中的α-1，4葡萄糖苷键，转化为低粘度的液化淀粉，产物为糊精和少量葡萄糖、麦芽糖。糖化酶作用的机理：糖化酶又叫葡萄糖淀粉酶，它将淀粉从非还原性末端水解α-1，4葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。β-淀粉酶：外切性淀粉酶，又叫淀粉1，4麦芽糖苷酶，水解淀粉成麦芽糖，主要用于饴糖、高麦芽糖、啤酒、醋等生产中。第26页,共120页，2024年2月25日，星期天操作方法1、取酶液1ml或酶粉2g，加入50ml烧杯中，用少量的乙酸－乙酸钠缓冲液(pH4.6)溶解，并用玻璃棒混匀，将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣再加入少量上述缓冲溶液。如此反复3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，用4层纱布过滤。再用滤纸滤清，滤液用于测定。浓缩酶液可直接吸取一定量于容量瓶中，用缓冲溶液稀释定容至刻度。2、测定：取甲乙两支试管中，分别加入2％可溶性淀粉溶液25ml，0.1mol/L乙酸－乙酸钠缓冲液（pH4.6）5ml，摇匀。于（40±0.2℃）的恒温水浴中预热5～10分。在甲管中加入酶制备液2ml，立即计时摇匀。在此温度下准确反应1小时后，立即在甲乙两管各加20％氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀。将两管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加酶制备液2ml（作为对照）。取两管中上述反应液各5ml加入碘量瓶中，准确加入0.1mol/LI2液10ml，再加入0.1mol/LNaOH溶液15ml，边加边摇匀，放置暗处15分钟，加入2mol/L硫酸2ml，用0.05mol/LNa2S2O3溶液滴定至无色为终点。3、计算：糖化酶酶活＝（A－B）×c×90.05×1／2×32.2／5×n（U／ml）A－空白试验消耗Na2S2O3溶液的毫升数B－样品消耗Na2S2O3溶液的毫升数C－Na2S2O3溶液的当量浓度n－稀释倍数90.05－1ml1mol/LNa2S2O3相当于葡萄糖毫克数1／2—折算成1ml酶液的量32.2—反应液总体积5－吸取反应液的毫升数为了方便计算，可按稀释倍数参考表计算，系数乘以滴定空白和样品所消耗0.05mol/LNa2S2O3溶液的差值（A－B）为酶活力单位。第27页,共120页，2024年2月25日，星期天果胶酶的活力测定方法1、原理：果胶酶水解果胶，生成半乳糖醛酸，生成半乳糖醛酸具有还原性糖醛基，可用次亚碘酸法定量测定，以此来表示果胶酶的活性。2、试剂和配制方法：（1）果胶粉（Sigma公司产品）10g／L水溶液。称取果胶粉1.0000g，精确到0.0002g，加水溶解，煮沸，冷却。有不溶物质需进行过滤。调pH至3.5，用水定容至100ml，在冰箱中储存备用，使用时间不超过3d。（2）硫代硫酸钠（Na2S2O3）标准溶液：浓度0.05mol/L，按GB601配制与标定0.1mol/L溶液，使用时准确稀释一倍。（3）碳酸钠(NaCO3)溶液：浓度为1mol/L，按GB601配制。（4）碘标准溶液（I2）：浓度为0.1mol/L，按GB601配制与标定，贮存于棕色瓶中。（5）硫酸溶液：浓度为2mol/L，取浓硫酸（相对密度1.84）5.6ml，缓缓加入适量水中，冷却后定容至100ml，摇匀。第28页,共120页，2024年2月25日，星期天（6）可溶性淀粉指示液（10g/L）:按GB603配制。（7）0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，pH为3.5。甲液：称取一倍结晶水柠檬酸21.01g，用水溶解并定容至1000ml；乙液：称取2倍结晶水柠檬酸三钠29.41g，用水溶解定容至1000ml

取甲液140ml、乙液60ml混匀，缓冲液的pH应为3.5，用pH调试。3、仪器：比色管25ml；恒温水浴（50±0.2）℃；容量瓶25ml、50ml、100ml、滴定管25ml。200ml、250ml；碘量瓶250ml；吸罐1ml和5ml；4、测定程序：精确称固体酶1克于50ml烧杯中，以上述柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液稀释定容、摇匀，4层纱布过滤，滤液备用。液体酶制剂准确吸1ml，用柠檬酸－柠檬酸钠稀释定容。甲乙两比色管→分别加入果胶溶液5ml→（50±0.2）℃预热5～10分→甲管加入柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液5ml，乙管加入4ml和稀释酶液1ml→立即摇匀计时→此温度下反应30分钟，加热煮沸5分终止反应→冷却→取甲乙管反应液各5ml→于碘量瓶中，准确加入1mol/L碳酸钠溶液1ml、0.1mol/L碘液5ml，摇匀于暗处20分钟→取出加入硫酸溶液2ml，用0.5mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3滴，继续滴定至蓝色刚好消失为其终点，计录甲管(空白)、乙管（样品）反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，同时做平行测定。第29页,共120页，2024年2月25日，星期天计算方法定义：1g酶粉或1ml酶液在50℃、pH3.5的条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。X＝（V1－V2）×c×0.51×194.14×n×10／（5×1×0.5）＝（V1－V2）×c×n×396.05其中X－样品的酶活力，U／g（U／ml）V1－空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml

V2－样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mlc－硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L0.51－1m

mol硫代硫酸钠相当于0.51m

mol的游离半乳糖醛酸。194.14－半乳糖醛酸的摩尔质量，g／moln－酶液稀释倍数10－反应液总体积，ml5－滴定时取反应混合物的体积，ml1－反应时加入稀释酶液的体积，ml0.5－反应时间，h第30页,共120页，2024年2月25日，星期天香菇漆酶的活性测定含铜的多酚氧化酶(苯二醇氧化还原酶)作用:降解木质素，使苯氧基类除草剂、工业废水驱除毒性。酶作用的底物：临联甲苯胺检测方法：参考文献，于0.2mol/L、pH4.0的醋酸缓冲液3.5ml中加入3.36×10-3mol/L的临联甲苯胺0.5ml，再加入适当稀释的酶液0.5ml，25℃反应5分钟后于595nm处比色。以每分钟使OD600增加0.01为一个酶活性单位。某大学的研究生报道的第31页,共120页，2024年2月25日，星期天尿酸酶嘌呤尿酸肾脏排泄尿酸尿囊素、CO2和过氧化氢缺乏尿酸酶，血清尿酸过高易导致高尿酸症，这是心血管疾病、痛风的主要诱因。细菌、酵母菌及植物中都能产生尿酸酶。尿酸酶第32页,共120页，2024年2月25日，星期天尿酸酶活性的测定是否有标准方法？重庆医科大学的研究：反应体系1.2ml，含1.156ml硼酸缓冲液（0.05mol/L,pH8.8,含0.10mmol/L二乙三胺五醋酸[DETAPA]），溶解在二甲基亚砜的3.75mmol/L尿酸0.024ml和0.02ml酶溶液，在25℃测定酶作用下293nm吸收变化初速度（延迟40sec后共记录1.0min），定义每分钟氧化1.0µmol尿酸的酶量为一个活性单位。第33页,共120页，2024年2月25日，星期天三、蛋白质纯化的主要步骤1.捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。2.中度纯化阶段:

目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。3.精制阶段：

除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。第34页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白质纯化的具体步骤原料的获得清理

组织破碎蛋白质成分的粗提蛋白质成分的细提纯蛋白的鉴别纯化方案最后第35页,共120页，2024年2月25日，星期天酶溶液的制备酶溶液的制备有三个过程:①材料预处理和破碎细胞②抽提③抽提液的浓缩。酶的抽提酶的抽提目的在于将尽可能多的酶、尽可能少的杂质从原料组织和细胞中引入溶液，以利于酶的纯化。（一）酶源材料的预处理动物材料要先去除结缔组织和脂肪组织，再捣碎；油料种子要先脱脂和脱壳，避免单宁等物质的干扰；微生物材料在抽提前也需将菌体与发酵介质分离。1、胞外酶的发酵液预处理:在发酵液中加凝固剂，通过离心沉淀或板框过滤机分离除去絮凝物或凝固物，取得澄清的酶液。第36页,共120页，2024年2月25日，星期天微生物细胞的破碎方法1.实验室的破碎方法2.工业上的破碎方法第37页,共120页，2024年2月25日，星期天2、胞内酶发酵液预处理如果是胞内酶首先要将菌体分离出来，并使其破碎细胞。材料应保持新鲜或添加抗氧化剂或立即冷冻处理，以防止酶变性失活。（1）机械破碎法：包括研磨法和细菌磨法。A、珠磨机法B、高压均浆器C、超声波法（2）非机械法：许多非机械方法都适用于微生物细胞的破碎，包括酶解、渗透压冲击、冻结和冻融、热处理、化学法溶胞等。第38页,共120页，2024年2月25日，星期天A、珠磨机法A.研磨法：研磨法是将微生物细胞与磨料（玻璃砂、石英砂、氧化铝等）混合，在研钵中研磨，细胞破碎后，用水或缓冲液抽提，得到粗酶液。实验室使用该方法。在工业的生产中，可以采用高速珠磨机（Beadmill），细胞破碎的机理是由于机械内圆盘高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。操作的过程中磨室的温度要升高，因此，需要冷却设备。一般革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚（15～50nm），肽聚糖占40％～90％，其余是多糖和磷壁酸，而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄(1.5~2.0nm)，最外面还有一层较厚的外壁层（8～10nm），外壁层主要由脂蛋白，脂多糖组成。因此，破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构。酵母菌的细胞壁的主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，根据Moor和Muhlethaler报导，酵母细胞壁后大约70nm；霉菌的细胞壁由几丁质和葡聚糖构成，有的还含有纤维状结构，所以强度有所提高。第39页,共120页，2024年2月25日，星期天B、高压均浆器B.高压匀浆器采用高压匀浆器破碎细胞的常用方法。利用高压迫使细胞悬浮液提高针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环形成细胞破裂。工业生产中采用的压力是55～75MPa。对于难破碎的酵母或处于生长静止其的细胞常常采用多次循环操作方法破碎细胞。第40页,共120页，2024年2月25日，星期天C、超声波法（2）超声波法－物理法超声波法是一种应用较多的破碎方法。使用频率是15～25千赫，机理是超声波产生强烈的冲击波压力，引起粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成剪切力使细胞破碎。缺点：是超声波引起温度剧烈上升，操作时要及时冷却，工业化生产要输入很高的能量来提供冷却，这是较困难的。此外，还有冻融法、滲透压法，后者适合于少量样品的处理。冻融法适合于细胞壁较脆弱的菌体，一些敏感的蛋白质可能反复冻融要变性。第41页,共120页，2024年2月25日，星期天非机械的方法（1）酶解法由于酶较贵，适于实验室研究。在发酵的后期加入细胞壁合成的抑制剂，导致类似于酶解的效果。还可采用抑制细胞壁合成方法能导致类似于酶解的效果，如用抗生素或环丝氨酸，阻止细胞壁物质合成。（2）反复冻结－融化法：第42页,共120页，2024年2月25日，星期天（二）抽提(胞内酶)大多数酶蛋白是球蛋白，因此，一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。抽提液要考虑酶的溶解性、稳定性等。（1）温度：一般要求低温0～4℃进行。但耐高温的酶也可在37℃进行，如胃蛋白酶。（2）pH：在酶的稳定范围，一般远离酶的等电点，即酸性蛋白酶宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白酶宜用酸性溶液抽提。（3）盐：大多数蛋白在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为0.020～0.050／L的磷酸缓冲液，0.15mol/LNaCl（4）抽提液的用量：一般采用原料液量的1～5倍，为了提高抽提效果，需反复抽提。第43页,共120页，2024年2月25日，星期天（三）抽提液的浓缩冷冻干燥法：采用这种方法能使多种酶长期保存。注意酶液最好是水溶液；冷冻前需将酶溶液脱盐。蒸发法：通常采用减压蒸发法。超过滤：此法是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择性透过微孔半透膜，而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。第44页,共120页，2024年2月25日，星期天酶的分离纯化技术2.酶的分离、纯化技术：自1926年Sumner从刀豆分离提纯第一个结晶脲酶以来，酶的分离、纯化工作进展迅速，迄今为止，科学家们已把300多种酶制成了结晶，达到了相当高的纯化程度，并发展了各种类型的分离纯化方法。2.1酶的分离、纯化程度：酶的产量是以活力单位表示的，因此，在整个分离过程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测、比较，这样才能确定酶的分离、纯化程度。酶的总活力：总活力＝酶活力×总体积（ml） ＝酶活力×总质量（g）第45页,共120页，2024年2月25日，星期天回收率回收率（Yieldpercent）是指提纯前与提纯后酶的总活力之比。它表示酶的提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。提纯倍数：提纯倍数是指提纯前后两者比活力之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯倍数愈大，提纯效果愈佳。这几个分离提纯过程有关参数，对于从事酶学研究及应用十分重要。在操作过程中还要特别注意防止酶的变性失活，对于食品级的酶，在整个分离纯化过程中要注意卫生，防止污染。

第46页,共120页，2024年2月25日，星期天四、酶蛋白质的分离与纯化方法1.根据溶解度不同的分离纯化2.根据分子大小不同的分离纯化3.根据电离性质不同的分离纯化4.根据配基特异性的分离纯化第47页,共120页，2024年2月25日，星期天1.根据溶解度不同的分离纯化方法（1）盐析沉淀法（2）等电点沉淀法（3）低温有机溶剂沉淀法（4）温度对蛋白质溶解度的影响第48页,共120页，2024年2月25日，星期天盐析沉淀法

常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。

各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。第49页,共120页，2024年2月25日，星期天

2.根据分子大小不同的分离纯化方法（1）透析和超滤法（2）分子筛层析原理：利用分子量的差异（3）密度梯度离心第50页,共120页，2024年2月25日，星期天3.根据电离性质不同的分离纯化方法（1）电泳法（2）离子交换层析阴离子交换树脂含有碱性基团[如一N(CH3)+3，OH-]，碱性基团解离出的OH—离子可以和溶液里的阴离子(如氨基酸阴离子)发生交换，然后被洗脱。氨基酸的洗脱顺序与阳离子交换柱相反。第51页,共120页，2024年2月25日，星期天4.根据配基特异性的分离纯化方法亲和层析法第52页,共120页，2024年2月25日，星期天酶分离纯化的方法沉淀技术凝胶过滤技术吸附层析离子交换层析亲和层析高压液相色谱（HPLC）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第53页,共120页，2024年2月25日，星期天各种分离纯化技术的顺序及衔接由于发酵液中的成分是多组份的，因此，不能指望只通过简单的程序，就能得到我们所需要的产品。必须将多种技术联合应用才能纯化出我们所需要的产品。对胞外酶纯化的程序大致如下：发酵液→过滤→盐析→分子筛→离子交换层析→聚丙烯酰胺凝胶电泳第54页,共120页，2024年2月25日，星期天第55页,共120页，2024年2月25日，星期天1沉淀法－硫酸铵盐析法沉淀法根据沉淀剂的不同，可以分为：（1）盐析法（2）等电点沉淀法（3）有机溶剂沉淀法（4）非离子型聚合物沉淀法（5）聚电解质沉淀法（6）高价金属离子沉淀法等。最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定,因此常用硫酸铵盐析酶。硫酸铵盐析酶的影响因素如下：第56页,共120页，2024年2月25日，星期天A、与酶组成相近的蛋白质，分子量愈大，沉淀所需盐的量愈少；蛋白质分子不对称性愈大越易沉淀。B、pH的影响:蛋白质的相对溶解度会随pH变化而变化很大;pH变化一个单位,溶解度就变化10倍。C、温度的影响:在高浓度盐的溶液中,蛋白质的溶解度随温度升高而减小,是因为蛋白质分子水化时要吸热,失水时就要放热,因而温度要升高,有利于失水而沉淀。D、起始硫酸铵浓度的影响：一般认为在温度和pH一定的条件下,某种蛋白质的沉淀有一定的硫酸铵饱和度,实际上沉淀所需的饱和度还和蛋白质的起始浓度有关。F、盐析的机理:蛋白质的盐析是由于静电作用引起的盐溶和疏水作用引起的盐析,是两种作用相互作用的结果。第57页,共120页，2024年2月25日，星期天第58页,共120页，2024年2月25日，星期天等电点沉淀法在低离子强度下,调pH到等电点,使蛋白质所带静电荷为零,能大大降低其溶解度。此法适用于疏水性较强的蛋白质,例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的浓聚物;但对一些亲水性强的蛋白质,如明胶,则在低离子强度溶液中,调pH至等电点并不产生沉淀。第59页,共120页，2024年2月25日，星期天有机溶剂沉淀法利用与水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质，在工业上也很重要，如血浆蛋白的分离纯化，现在仍采用此法。它与盐析法不同，可作为盐析法的补充。机理:加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应,这些效应结合起来,使蛋白质沉淀。其中主要效应是水的活度降低。当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上电荷基团或亲水基团的水化程度降低，或者导致蛋白质分子聚集而沉淀。使用注意事项（1）：降低温度，可增加收率和减少蛋白质的变性。加溶剂于水中，常为放热反应，故操作时需冷却。如乙醇沉淀血浆蛋白，在－10℃下进行。（2）溶剂须能与水互溶，但与蛋白质不起作用，最常用的溶剂是乙醇和丙酮。（3）蛋白质的分子量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。4、染色：考马斯亮蓝法、银染法。第60页,共120页，2024年2月25日，星期天硫酸铵盐析的研究内容（1）盐析剂选择、盐析浓度的确定（2）盐析后酶活的回收率

(3)盐析液的蛋白含量测定第61页,共120页，2024年2月25日，星期天硫酸铵使用的要点盐析之前要测定酶活性、总蛋白含量，硫酸铵要研磨成粉末状；加入发酵液中要缓慢加入；要在冰浴上进行，并不断进行磁力搅拌；硫酸铵缓慢加入完后要在4℃冰箱中放置过夜，然后低温离心分离蛋白质，分步测定酶活，确定最适的盐析浓度。第62页,共120页，2024年2月25日，星期天3、硫酸铵盐析的实验结果（1）最佳盐析硫酸铵的用量与发酵液的量和酶蛋白的单位浓度有关。（2）当发酵液为26U／ml左右时，发酵液300毫升盐析结果为如下：(3)当发酵液为30U／ml左右时，发酵液600毫升盐析结果为如下：第63页,共120页，2024年2月25日，星期天第64页,共120页，2024年2月25日，星期天第65页,共120页，2024年2月25日，星期天第66页,共120页，2024年2月25日，星期天进行菌株的复壮工作分离单菌落挑大的、中等大小菌落

在平板上作水解圈实验第67页,共120页，2024年2月25日，星期天2、盐析酶液的透析及浓缩1.盐析酶液的透析：采用孔径为2万的透析袋，将酶液装入透析袋中，用与柱洗脱液相同液体透析，一般要换透析液6～8次，可见酶液的色素明显变淡。2.浓缩：采用分子量为2万的聚乙二醇（PEG），将透析好的酶液放入烧杯中，直接将透析袋放入，倒入PEG入烧杯盖在透析袋上，常常观察，根据样品的量及需要浓缩的倍数决定时间，一般3～5小时即可。第68页,共120页，2024年2月25日，星期天4、色谱的分离研究1、离子交换层析（DEAESephadexA-25）2、葡聚糖琼脂凝胶层析柱3、酶蛋白分子量的测定（SDS－PAGE）第69页,共120页，2024年2月25日，星期天（1）DEAESephadexA-25层析1、DEAESephadexA-25凝胶的分离范围：30000～200000。2、DEAESephadexA-25凝胶的溶胀方法：溶胀度为5～9，先用蒸馏水浸泡，除去细小的颗粒，再采用15倍（50克加蒸馏水750ml）蒸馏水水浴煮沸2～3小时，关键点要轻搅拌，在浸泡24小时充分溶胀，同时换几次蒸馏水除去细小颗粒备处理。3、用4倍2mol/LHCL搅拌4小时，水洗至中性，再用2mol/LNaOH搅拌，水洗至中性。第70页,共120页，2024年2月25日，星期天DEAESephadexA-25(50)层析原理离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的高分子固态化合物，它的化学稳定性良好，且具有离子交换能力。离子交换树脂是多孔的、疏松的海绵样的结构。高分子树脂骨架，不能移动离子交换树脂可以移动的活性离子（阳离子、阴离子），在树脂骨架中可以进进出出，就发生交换现象。第71页,共120页，2024年2月25日，星期天★第72页,共120页，2024年2月25日，星期天离子交换原理：不是单一的吸附作用，包括复杂的吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程综合作用的结果。（1）发酵醪中的离子经吸附或扩散到树脂的表面；（2）穿透过树脂的表面，被吸收或扩散到树脂内部的活性中心；（3）这些离子与树脂中原有自由离子互相交换；（4）交换出来的离子自树脂内部的活性中心扩散到树脂的表面；（5）再从树脂表面扩散到溶液中去。第73页,共120页，2024年2月25日，星期天DEAESephadexA－25的反离子50克介质溶胀好0.5mol/LHCl浸泡30分钟蒸馏水反复洗至中性用缓冲液0.02MTris-HClpH8.0浸泡平衡到pH8.0

共370ml介质。关键点：一定要用缓冲液平衡好到要求的pH才能装柱。蒸馏水pH为6.5～6.6，装柱后平衡三天也不会成功。第74页,共120页，2024年2月25日，星期天离子交换层析pH及洗脱离子强度⑴pH：15ml塑料离心管2ml介质平衡到pH7.0、7.5、8.0、8.5

加1ml酶液及不同pH的缓冲液6.5ml作用1.5小时5000rpm离心15分钟取上清液测定蛋白质含量。

⑵结果：考马氏亮蓝法对照7.07.58.08.5A595nm0.6420.7000.6990.6440.645第75页,共120页，2024年2月25日，星期天⑶洗脱离子强度的选择结果洗脱离子强度的选择方法：15ml塑料离心管2ml介质缓冲液平衡到pH8.0、

加1ml酶液及不同离子强度的NaCl缓冲液6ml作用1小时5000rpm离心15分钟取上清液测定蛋白质含量。结果如下：考马氏亮蓝法对照0.10NaCL0.15NaCL0.20NaCL0.25NaCLA595nm0.6320.6410.6580.6700.674第76页,共120页，2024年2月25日，星期天不同离子强度洗脱液活性检测结果打孔法加样，24小时的结果：加样20ul0.1MNaCl0.15MNaCl0.20MNaCl0.25MNaCl酶液水解圈（cm）0.71.21.21.42.4第77页,共120页，2024年2月25日，星期天DEAESephadexA-25装柱法采用一步法装柱：柱清洗净垂直固定柱内装1／10的缓冲液介质超声波脱气搅拌介质，边搅拌边加入介质一次加完当看见下面有介质沉淀立即打开柱下口。关键点：在柱未沉降完全之前一定不能动柱，否则有分层以及柱床不平坦。第78页,共120页，2024年2月25日，星期天DEAESephadexA-25上样及洗脱1、上样：盐析透析及浓缩酶液34ml(24ml)沿着柱壁缓慢加样，保证柱床平坦加入10ml缓冲液流至与柱床相切又加入10ml缓冲液流至与柱床相切加入30ml缓冲液封柱口NaCl梯度洗脱，部分收集器收集，每管4.3ml，流速26ml／小时。2、UVA280nm检测蛋白质的吸收峰结果：第79页,共120页，2024年2月25日，星期天第80页,共120页，2024年2月25日，星期天DEAESephadexA-25结果图第81页,共120页，2024年2月25日，星期天第82页,共120页，2024年2月25日，星期天分子筛层析的机理第83页,共120页，2024年2月25日，星期天（2）分子筛层析SephadexG-751、溶胀胶、装柱及上样方法同离子交换介质，上离子交换收集活性样浓缩23ml。（柱床体积的1～4％，25～30％）2、洗脱液为0.05M／LTris-HCl。3、收集液3ml／支，流速18ml／小时。第84页,共120页，2024年2月25日，星期天

分子筛层析法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来。测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex第85页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白质浓度的测定-紫外吸收法（UV）原理：由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收峰在280nm波长处。在波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系。方法优点：简单快速。缺点：对于测定蛋白质与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的有一定的误差；样品中嘌呤和嘧啶等吸收紫外线的物质，也会出现误差。第86页,共120页，2024年2月25日，星期天第87页,共120页，2024年2月25日，星期天分子筛层析SephadexG-75结果图第88页,共120页，2024年2月25日，星期天亲和层析法（affinitychromatography）

这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

第89页,共120页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂的的处理、再生、转型和保存再生：是指使树脂恢复原状的方法叫再生。转型：是指使树脂带何种离子的处理方法，如希望带H+则用HCL处理，希望带NH4+则用NH4OH处理；希望阴离子树脂转型也这样处理，带OH-用NaOH处理，带H+则用HCL处理，但最后均要水洗到中性。保存：一般可反复使用上千次，阴离子交换树脂用用HCL处理后水洗到中性，去水至湿润态密封保存，阳离子树脂用NaOH处理处理后水洗到中性同上防止干燥长霉菌。也有介绍用70%的酒精浸泡密封冰箱保存。第90页,共120页，2024年2月25日，星期天第91页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白质的电泳技术蛋白质电泳的目的：检测蛋白质的分子量测定蛋白质的纯度第92页,共120页，2024年2月25日，星期天在等电点时(Isoelectricpoint，pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。第93页,共120页，2024年2月25日，星期天

蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。第94页,共120页，2024年2月25日，星期天

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）。用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理。蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物。不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。第95页,共120页，2024年2月25日，星期天1.变性的本质

蛋白质变性作用的实质仅仅破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的次级键，导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而不涉及一级结构的改变或肽键的断裂。第96页,共120页，2024年2月25日，星期天SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，各种蛋白质所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。但为了消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度梯度电泳，利用孔径的不同引起的分子筛效应将蛋白质分开。也可在整个电泳体系中加入SDS（十二烷基硫酸钠sodiumdodecylsulfate），则电泳的迁移率主要依赖于分子量，这种方法称为SDS，分为连续的和不连续的两种。第97页,共120页，2024年2月25日，星期天（3）SDS－PAGE电泳检测分子量1、分离胶：10％、12％，主要起分子筛作用。2、压缩胶：相同。作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，提高分离效果。3、在蛋白质样品加1%SDS和1%的巯基乙醇，100℃水浴3分钟，凝胶中加入SDS。4、点样：样品与溴酚蓝染料混合，15～18ul。5、电泳缓冲液：加SDS。6、电泳：开始电流为15mA，然后30mA电泳，当染料距底部1.5cm时，停止电泳。第98页,共120页，2024年2月25日，星期天连续系统SDSD：

连续的电泳缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应迁移；不连续的SDS:不连续电泳体系中缓冲液的离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场泳动不仅有电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应，因此分离的条带清晰度和分辨率均较前者好，分辨率较连续的高出2倍左右。第99页,共120页，2024年2月25日，星期天SDS－PAGE电泳检测分子量方法：处理样品样品1%SDS和1%的巯基乙醇100℃水浴3分钟制备压缩胶制备分离胶（10％、12％）加电泳缓冲液加SDS点样15～18ul电泳开始电流为15mA然后30mA电泳，当染料距底部1.5cm时，停止电泳。第100页,共120页，2024年2月25日，星期天考马斯亮蓝染色固定液：50%甲醇454毫升，46毫升的冰乙酸。染色液：R250，用固定液配置，染色1小时。脱色液：冰乙酸75毫升，甲醇50毫升，蒸馏水定容至1000毫升，脱色过夜。第101页,共120页，2024年2月25日，星期天第102页,共120页，2024年2月25日，星期天银染色法灵敏度高：比考马斯亮蓝灵敏100倍，有ng的蛋白质可显带。染色方法：烦琐，费时。胶固定染色显色褪色整个过程要带手套，防止污染。第103页,共120页，2024年2月25日，星期天（B）银染的染色结果第104页,共120页，2024年2月25日，星期天蛋白酶分子量的确定分子量的确定：相对迁移距离(Rf)＝蛋白质分子迁移距离cm