茯苓皮三萜提取物化学成分及抗肿瘤活性研究

茯苓皮三萜提取物化学成分及抗肿瘤活性研究由于环境污染加剧、营养失衡以及生活压力加大等因素,肿瘤已经成为影响和威胁人类健康的第二大常见疾病。从中药中寻找抗肿瘤活性部位及有效单体化合物已成为开发抗癌新药的途径之一。茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw).Wolf的干燥菌核,含有羊毛甾烷型四环三萜类化合物,这类化合物普遍具有抗肿瘤的生物活性。茯苓中羊毛甾烷三萜多为同分异构体,并且含量非常低,因此,对这类成分进行分离纯化非常困难,这严重阻碍了其抗肿瘤活性的研究。实地调查发现,在采收时,由于用药量不大,其外皮(茯苓皮)常被当做废弃料丢弃。研究表明,茯苓皮中羊毛甾烷型四环三萜类化合物含量较高,约为其内核(白茯苓)的十倍,同时三萜化合物的种类也比白茯苓丰富,这非常利于对这些化合物的抗肿瘤活性进行系统的研究。因此,从茯苓皮中分离制备羊毛甾烷三萜类成分并阐明其抗肿瘤药效活性是一项非常有意义的研究。本文制备了茯苓皮羊毛甾烷三萜提取物,考察了茯苓皮三萜提取物的体内、体外抑瘤活性；采用传统柱色谱、高速逆流色谱、超临界流体制备色谱技术对茯苓皮三萜提取物中化学成分进行了分离纯化；在此基础上,考察了三萜单体化合物的癌细胞毒活性,分析了构效关系。主要研究内容如下：1茯苓皮乙酸乙酯部位的定性与定量分析采用LC-MS对茯苓皮乙酸乙酯部位中羊毛甾烷三萜色谱峰进行了鉴定,指认出13个羊毛甾烷三萜化学成分；采用紫外可见分光光度法对茯苓皮乙酸乙酯提取物中总三萜的含量进行了测定,结果表明,茯苓皮乙酸乙酯提取物中羊毛甾烷三萜的总量大于50%。因此茯苓皮乙酸乙酯部位可作为羊毛甾烷三萜提取物用于进一步的化学成分及药理学活性研究。2茯苓皮三萜提取物抗肿瘤活性研究采用网络药理学方法对茯苓中羊毛甾烷类三萜化学成分的药理活性进行了预测,结果表明,这些三萜与乳腺癌、宫颈癌、肺癌等多种肿瘤疾病相关。建立Lewis荷瘤小鼠模型,考察了茯苓皮三萜提取物体内抗Lewis肺癌活性,结果表明茯苓皮三萜提取物在65mg/kg、90mg/kg剂量连续灌胃给药15天,抑瘤率与模型对照组比较具有统计学差异(P<0.05),分别为41.27%和58.87%。采用碱溶酸沉法对茯苓皮三萜提取物进行了初步分离,得到三萜提取物的两个不同极性部位,进一步对这两个部位的体外抑瘤活性进行了研究,结果表明,茯苓皮羊毛甾烷三萜提取物不同极性部位对肿瘤细胞均有抑制活性,并表现出构效关系的倾向,为其单体化合物抗肿瘤活性构效关系研究打下了基础。3茯苓皮三萜提取物化学成分分离3.1传统柱色谱法分离三萜类成分采用硅胶柱色谱对茯苓皮三萜提取物进行初步分离后,采用ODS中压制备和半制备高效液相色谱对每个组份反复纯化,共得到26个三萜化合物。采用MS和NMR对化合物的结构进行了鉴定,分别为dehydrotrametenolicacid(1)、trametenolicacid(2)、dehydroeburicoicacid(3)、eburicoicacid(4)、pachymicacid(5)、3-O-acetyl-16α-hydroxytrametenolicacid(6)、poricoicacidAE(7)、dehydropachymicacid(8)、poricoicacidGE(9)、poricoicacidAM(10)、poricoicacidBE(11)、poricoicacidGM(12)、3-O-acetyl-16α-hydroxydehydrotrametenolicacid(13)、(3β,16a)-3-acetyloxy-16-hydroxy-24-methylenelanosta-5,7(9),11-tetraene-21-oicacid(14)、polyporenicacidC(15)、16α-hydroxyeburiconicacid(16)、3β,15α-dihydroxylanosta-7,9(11),24-triene-21-oicacid(17)、3β,16a-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oicacid(18)、dehydrosulphurenicacid(19)、16a-hydroxytrametenolicacid(20)、dehydrotumulosicacid(21)、tumulosicacid(22)、poricoicacidA(23)、16α-hydroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31),25(27)-pentaene-3,21-dioicacid(24)、poricoicacidB(25)、poricoicacidG(26),其中17和19为首次从茯苓中分离得到,9、11、14和24为新化合物。3.2高速逆流色谱法分离茯苓皮三萜类成分建立了茯苓皮三萜提取物中羊毛甾烷类三萜的高速逆流色谱分离方法。首先采用pH-区带精制逆流色谱对羊毛甾烷提取物中目标化合物进行了富集,溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(3：7：5：5,v/v),上相加入10mM的三氟乙酸为固定相,下相加入10mM的氨水为流动相。经过pH区带精制逆流色谱富集后,从1.0g粗提物中得到200mg目标成分的混合物。进一步采用常规高速逆流色谱对目标成分混合物进行分离,溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(0.8：1.2：1.2：0.9,v/v)。一次进样120mg,可得到50mg的poricoicacidA和5mg的poricoicacidB,经HPLC测定,其纯度分别为95%和98%。3.3高速逆流色谱法分离白茯苓中三萜类成分建立了白茯苓中羊毛甾烷三萜化合物的高速逆流色谱分离方法。首先采用碱溶酸沉法对白茯苓乙醇提取物进行了初步分离,可分为碱不溶解部位和酸沉淀部位。对这两个部位分别采用高速逆流色谱进行分离,共得到六个羊毛甾烷三萜类成分,这些化合物经ESI-MS、1H-NMR及13C-NMR鉴定为dehydropachymicacid、pachymicacid、3-epi-dehydropachymicacid、poricoicacidB、dehydrotumulosicacid和3-epi-dehydrotumulosicacid,经HPLC测定,其纯度分别为94.1%、96.2%、93.5%、85.9%、80.1%和93.1%。3.4超临界流体制备色谱分离茯苓皮中难以分离纯化的三萜类成分茯苓乙酸乙酯部位经硅胶柱色谱、反相C18中压柱色谱法富集、初级分离后,采用超临界流体制备色谱分离,以甲醇-C02(15%：85%)等度洗脱,得到三个羊毛甾烷类化合物。化合物经ESI-MS、1H-NMR及13C-NMR鉴定为polyporenicacidC、poricoicacidAM和3-O-acetyl-16a-hydroxydehydrotrametenolicacid。经HPLC分析,其纯度分别为93%、80%和99%。与常规反相制备色谱相比,超临界流体制备色谱在分离制备三萜类化合物上具有简便、快速的优点。4茯苓皮三萜单体化合物体外抗肿瘤活性研究选取两种取代基团完全不同的羊毛甾烷三萜单体化合物(poricoicacidAM和3-O-acetyl-16a-hydroxytrametenolicacid),研究它们对8种肿瘤细胞的体外抑制活性,结果表明这两个化合物对8种肿瘤细胞均有不同程度的抑制活性,与上述网络药理学活性预测结果及体内抑制Lewis肺癌的作用一致。在此基础上,考察了24个羊毛甾烷三萜单体化合物体外对MGC-803和HepG2的细胞毒性,并对其细胞毒活性构效关系进行研究。结果表明,上述单体化合物具有不同程度的肿瘤细胞抑制活性,并且表现出了构效关系,即16位或15位羟基、BC环上的双键均可增强羊毛甾烷三萜对肿瘤细胞的毒性；3位羟基乙酰化后,24(25)-烯型羊毛甾烷类三萜化合物对肿瘤细胞的毒性增强,而24(31)-烯型羊毛甾烷三萜化合物对肿瘤细胞的毒性降低。综上,本研究对茯苓中羊毛甾烷三萜单体化合物进行了网络药理学预测,在此基础上对茯苓皮三萜提取物对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤活性进行了研究；体外抑瘤活性实验表明茯苓皮三萜提取物具有抑瘤活性。在明确了茯苓皮三萜