细菌内毒素检查法

关于细菌内毒素检查法三、细菌内毒素检查法（一）概述1.内毒素(Endotoxin)：即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A，菌体死亡崩解后释放出来。2.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。

第2页,共19页，2024年2月25日，星期天鲎的图片鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素污染进行监测。

第3页,共19页，2024年2月25日，星期天4.检查方法：包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。5.检查的意义：注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射剂安全性的重要质量指标。第4页,共19页，2024年2月25日，星期天（二）凝胶法1.原理：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数）内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。该法优点：快速、灵敏。

2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂①细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵敏度。第5页,共19页，2024年2月25日，星期天②细菌内毒素工作标准品（CSE）：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其质量的相当效价。1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。用于鲎试剂灵敏度的复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。③细菌内毒素检查用水（BET水）：系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。是细菌内毒素检查专用水。④鲎试剂和鲎试剂灵敏度：a、鲎试剂的生产：利用鲎血制备而成。鲎试剂的种类：美洲鲎试剂（LAL）、中国鲎试剂（TAL）、圆尾鲎试剂（CAL）。第6页,共19页，2024年2月25日，星期天B、鲎试剂的规格：是指每支鲎试剂的装量，如：0.1ml、0.5ml。一般来说，规格是多少就用多少细菌内毒素检查用水复溶。如：0.1ml就用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶。C、鲎试剂标示灵敏度：细菌内毒素检查的规定条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。⑤细菌内毒素的限值（L）：哺乳动物对细菌内毒素的量有一定的耐受力，只有内毒素超过一定的限度，才会引起热原反应。因此内毒素的检查是一个限量检查，只要不超过限值，产品就合格。确定限值的方法—从质量标准正文中查出。第7页,共19页，2024年2月25日，星期天⑥最大有效稀释倍数（MVD）：供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的测定。MVD=CL/入。L：内毒素限值；c：供试品溶液浓度，当L以EU/ml表示时，c=1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/u表示时，c的单位为mg/ml或u/ml，如：供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD=1例如：称取mg供试品Vml移取注射液xmlVmlMVD？C最大有效L×m/v=L×c样≥入,c样≥入/LEU/mgL·x/v=L×MVD≥入,MVD≥入/LEU/ml第8页,共19页，2024年2月25日，星期天3.检查方法（1）检查程序：①实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素）②确定药品的细菌内毒素限值L；③选择鲎试剂的灵敏度入；④计算供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度；⑤鲎试剂灵敏度的复核；⑥药品与鲎试剂的相容性的初选实验（无干扰浓度初选）；⑦供试品的干扰实验的验证（正式干扰试验）；⑧供试品日常的内毒素限量检查。在实际操作过程中，（1）→（4）顺序可变，（5）→（8）顺序不能变。第9页,共19页，2024年2月25日，星期天(2)实验准备A、除去干扰：试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。B、材料与器具：细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水、漩涡混合器、37±1℃试管恒温仪、稀释、移液容器、试管架或试管浮板、酒精灯、消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊子、封口胶布标记纸等。第10页,共19页，2024年2月25日，星期天(3)鲎试剂灵敏度的复核试验A、复核的条件：本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。第11页,共19页，2024年2月25日，星期天B、操作：

0.1ml/支规格鲎试剂原安瓿18支

复溶0.1ml内毒素检查用水4支4支4支4支2支2.0λ内毒素溶液1.0λ内毒素溶液0.5λ内毒素溶液0.25λ内毒素溶液内毒素检查用水0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml内毒素工作标准品或国家标准品内毒素检查用水溶解15min稀释37±1℃保温1h呈阳性呈阴性结果有效计算鲎试剂灵敏度

式中：X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒素检查，并以λC为该批鲎试剂灵敏度第12页,共19页，2024年2月25日，星期天(4)细菌内毒素检查-凝胶法-干扰试验按表制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液——————2B2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D无/检查用水——————2第13页,共19页，2024年2月25日，星期天干扰试验结果判定前提：A和D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下列计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。

Es=lg-1（ΣXs/4)

Et=lg-1（ΣXt/4)式中

Es、Et分别为系列溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值(lg)。当Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ）及0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。第14页,共19页，2024年2月25日，星期天（5）检查方法①取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2入浓度溶液②取检品S，计算MVD③把它稀释成SMVD④取鲎试剂8支（0.1ml/支），2支作为样品检查管(S1、S2)，2支标记为阳性对照，2支为阳性产品对照，2支标记为阴性对照第15页,共19页，2024年2月25日，星期天举例-清开灵注射液中

细菌内毒素的检查设检品为S，L=1.0EU/ml，选用效价为0.06EU/支、入=0.06EU/ml的鲎试剂，使用的细菌内毒素的工作标准品的效价为10EU/支。参数及MVD已经过预试验验证。操作步骤（1）取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2入浓度溶液，即E0.12.（2）计算最大稀释倍数MVD=L/入=1.0/0.06=16倍（3）取检品S，把它稀释呈SMVD：0.2mlS+3.0ml水→SMVD16第16页,共19页，2024年2月25日，星期天（4）取鲎试剂8支（0.1ml/支），两支作为样品检查管(S1、S2)，2支标记为阳性对照，2支为阳性产品对照，2支标记为阴性对照，如下图所示s1s2阳性对照阳性产品对照阴性对照0.1ml水+0.1mlSMVD160.1ml水+0.1mlSMVD160.1ml水+0.1mlE2入0.1mlE2入+0.1mlSMVD160.2ml水第17页,共19页，2024年2月25日，星期天（5）封闭管口，摇匀，放入37±1℃