2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修三3-1+重组DNA技术的基本工具教学设计

3.1重组DNA技术的基本工具一、教材分析（一）教学目标1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3.进行DNA的粗提取与鉴定。（二）教学重点和难点1.教学重点（1）重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。（2）DNA的粗提取与鉴定。2.教学难点（1）基因工程载体需要具备的条件。（2）DNA的粗提取与鉴定。（三）编写思路本节内容是学习本章其他内容的基础。由于重组DNA技术所需的“分子工具”对学生而言是抽象的，因此教材在“从社会中来”栏目中创设了具体的培育转基因番木瓜的情境，让学生认识到培育转基因番木瓜需要用到专门的“分子工具”，进而引导他们思考用到了哪些“分子工具”，以及这些“分子工具”各具有什么特征。本节内容的编排主要遵循“简约、形象、诱思”的原则。“简约”体现在重组DNA技术所需的“分子工具”种类多样，根据课程标准的内容要求，同时考虑到高中生物学课程的基础性，教材只把三种基本的工具介绍给学生，并未拓展。“形象”一方面体现在教材给一些抽象的文字描述配了形象、直观的插图，如“限制酶切割DNA分子产生两种不同末端的示意图”可以使学生准确地理解切割的部位和“黏性”的内涵；“大肠杆菌及质粒结构模式图”可以使基因工程载体需要具备的条件的相关内容变得容易理解。另一方面，教材采用了打比方的方法，使三种基本工具的作用“形象化”，这样也是为了便于学生理解和掌握。“诱思”体现在教材针对学习的内容，提出一些相应的问题，启发学生思考。例如，在介绍限制酶时，提出“推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么”的问题，是为学生深入理解限制酶在生物体中的作用打开思路；学，生在学习DNA连接酶时，很自然地会想到学过的催化脱氧核糖核昔酸聚合的DNA聚合酶，提出"DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗”的问题，可以引导学生分析两者的不同作用，从而达到让他们深入认识DNA连接酶的目的。本节安排的“思考，讨论重组DNA分子”，意在让学生通过模拟制作和讨论相关问题，初步感受构建重组DNA分子的过程，并进一步熟悉、理解限制酶和DNA连接酶的作用。“到社会中去”安排了让学生了解生产和销售“分子工具”的公司生产产品的情况，分析相关上市公司的股票价格走势的活动，这些活动超越了生物技术本身的范畴，突出了生物技术在社会经济活动及日常生活中的重要作用。对学生而言，活动既新颖又具有积极的意义，他们在完成活动的过程中，能体会到科学、技术、社会三者间的关系。由于重组DNA技术是在DNA分子水平上进行的操作，提取和鉴定DNA是该技术涉及的最基础的操作，因此本节最后安排了“探究，实践DNA的粗提取与鉴定”活动，让学生学习相关操作。通过这个活动还可以帮助学生巩固在必修课中已经学过的DNA的结构和理化性质的知识，使他们对DNA这一微观分子形成一定的感性认识。二、教学建议本节教学建议安排2课时，其中1课时用于开展“探究，实践”活动。在教学中可以按照教材的安排先讲解重组DNA技术的基本工具的内容，再开展探究实践活动，也可以先开展探究实践活动后讲解。具体的教学建议如下。（一）结合基因工程应用的实例引人本节课的学习本节课是学习基因工程的开端，课前可以带领学生参观当地举办的与基因工程有关的展览、转基因实验基地、转基因作物种植基地等，或指导学生借助互联网、科普杂志等，初步了解一些基因工程应用的实例；也可以利用教材中的素材，如章引言中培育转基因抗虫棉的实例，本节开篇“从社会中来”栏目中培育转基因番木瓜的实例，提出本节课要解决的问题，即在基因工程的操作中需要用到哪些“分子工具”，从而引人本节课的学习。（二）引导学生在分析旧知识的基础上理解和掌握新知识本节的内容是建立在必修1教材中酶的作用和特性，必修2教材中噬菌体侵染细菌的实验、DNA的结构和复制等相关内容的基础上的。引导学生建立新旧知识之间的联系，将有助于他们理解和掌握新知识。例如，在讲授限制酶有关的内容时，可以设置问题“限制酶从哪里寻找”，引导学生联系噬菌体侵染细菌的实验，认识到细菌等原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但它们却不受影响，这是因为它们在长期进化的过程中形成了一套防御机制，限制酶就是它们的一种防御性工具，从而让学生了解限制酶的来源和理解它们存在的意义；在介绍限制酶的作用部位时，还要联系DNA的结构来帮助学生理解限制酶作用的特点。此外，在介绍DNA连接酶有关的内容时，可以联系学生已经学过的DNA聚合酶的相关知识，通过对两种酶进行比较，来加深他们对DNA连接酶的认识。（三）组织好教材中的“思考，讨论”活动，帮助学生理解“分子工具”的本质特征基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，属于微观层面，学生在日常生活中很少接触到，对此比较陌生，难于理解。因此，在教学中要充分利用教材中的生动形象的比喻、直观的插图、模拟制作活动等帮助学生增加感性认识。教材“思考，讨论”中的模拟制作活动对学生理解“分子工具”的本质特征具有十分重要的作用。教材中主要模拟的是限制酶和DNA连接酶的作用，教学时可以让活动内容更加丰富，如可以增加不同的DNA片段，模拟不同限制酶的切割，甚至可以增加对载体的模拟，在载体中画出相应的关键结构以及需要切割的DNA片段等。活动的安排可以按照教材中的顺序，在学生学习完本节内容后开展，以反馈检测学生对前面内容的掌握情况；也可以边讲授相关的内容，边带领学生进行活动，通过任务驱动，让学生在活动的过程中理解工具的作用。开展活动的同时，要注意利用好教材中的讨论题引导学生展开讨论，否则模拟活动可能会变成简单的模仿。（四）借助科学史，让学生认同基因工程的诞生离不开技术创新基因工程的原理看似很简单，即将外源基因导入受体细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录和翻译，进而赋予生物新的遗传特性。但其实从理论研究到工程实践的过程并不简单，这条发展之路离不开一项项创新技术的推动，教学中应该让学生明白这一点。可以通过引导学生自主阅读本章的“科技探索之路”，补充与三种“分子工具”发现历程相关的科学史资料，或让学生在课下查找相关资料，帮助他们认识到基因工程得以实现离不开三种“分子工具”的发现和成功运用，进而深刻体会到技术创新的重要意义。三、“探究·实践”指导DNA的粗提取与鉴定提取与鉴定DNA是基因工程中获取目的基因的基础，本实验通过让学生体验DNA的粗提取与鉴定的过程，帮助学生了解DNA的理化性质，让他们明白如何利用物质的理化性质，用物理和化学的方法进行分离和提纯。（一）材料准备植物材料：新鲜的洋葱、菠菜、菜花、香蕉、草莓等，若准备的植物材料不马上使用，可以将其放入冰箱冷藏或冷冻保存。动物材料：新鲜的猪肝、鱼白（鱼的精巢）等，若准备的动物材料不马上使用，也可以将其冷藏或冷冻保存。（二）实施建议1.DNA的粗提取（1）如果以菜花为实验材料，由于它的硬度较高，容易出现研磨不充分的情况，需要延长研磨的时间，而如果研磨时间太长，研磨时产生的热量可能会影响DNA的提取量，因此有条件的学校可以在材料处理的过程中加入纤维素酶，这样研磨的效果较好。如果以洋葱为实验材料，它的气味相对刺激，可以为学生准备护目镜，并注意通风。不同的实验材料，其DNA的含量有所差别，香蕉、草莓、鱼白等材料中的DNA含量较高。该实验也可以选取各种植物的叶为实验材料。叶中往往含有大量的蛋白多糖、丹宁和色素等杂质。在粗提取过程中大多数蛋白质可以通过氯仿处理变性、沉淀后被除去（参见本部分第5条建议的内容）；大多数糖类杂质较难除去，它们在浓度较高时常常会使提取物呈胶状，从而影响鉴定的结果，实验前可将材料置于低温、暗处保存，以降低多糖的含量。[2]（2）本实验处理植物材料的研磨液中含有SDS（十二烷基硫酸钠），EDTA（乙二胺四乙酸）、Tris（三甲基氨基甲烧）等试剂。SDS可使蛋白质变性与DNA分离；EDTA是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA；Tris提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。实验中若遇到实验试剂缺乏的情况，可以用家用洗洁精（含有SDS）或质量百分比为10%的洗衣粉水溶液（含有蛋白酶和表面活性剂，可用温水溶解洗衣粉）替代研磨液，也能达到裂解细胞膜、让蛋白质变性的目的。还可以在研磨、过滤后得到的滤液中加入嫩肉粉（含有木瓜蛋白酶），并在适宜温度的水浴中加热以加快反应速率，促使部分蛋白质水解。下面以香蕉为例，介绍学生在家就可以完成的DNA粗提取的操作。香蕉中DNA的粗提取实验①取一段长约2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。②加入10mL温水，2g食盐，5滴洗洁精，充分研磨。③用双层纱布过滤研磨液，收集滤液。④向滤液中加人2g嫩肉粉，混合均匀。⑤将滤液置于55~60℃（木瓜蛋白酶作用的最适温度）的水浴中加热5~10min。⑥冷却，加入等体积、预冷的体积分数为95%的酒精。⑦静置2~3min，用玻璃棒（或筷子）挑取白色絮状析出物。（3）教师还可以布置学生在课前查阅有关DNA在不同浓度NaCI溶液中溶解度发生变化的资料，以此为依据设计其他粗提取DNA的方案，从而加深学生对DNA理化性质的认识，提高他们的科学探究能力。（4）若提取的DNA中含有较多的杂质，鉴定效果不明显，教师可以引导学生思考提取的DNA中可能有哪些杂质，能用什么方法鉴定这些杂质等。例如，双缩脉试剂可用于鉴定蛋白质。（5）若想提高提取的DNA的纯度，可以在研磨、过滤后得到的滤液中加入等体积的氯仿，离心后取上清液，再加人等体积、预冷的体积分数为95%的酒精以析出DNA。这样操作的原因是氣仿能使蛋白质失去水合状态而变性，从而析出；离心后，溶液会分层，上层为水相，下层为有机相（氯仿）；DNA溶解在上层，析出的蛋白质的密度比水的大，比氛仿的小，它分布在水相与有机相中间，这样就实现了蛋白质与DNA的分离。2.DNA的鉴定（1）DNA中嘌呤核昔酸上的脱氧核糖遇酸生成w-羟基-y-酮基戊醛，后者再和二苯胺试剂作用呈现蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关，可以加入适量乙醛.以提高反应的灵敏度。（2）DNA与二苯胺试剂反应后的溶液对波长为595nm的光有最大吸收峰，并且DNA的含量在一定范围时，吸光度的值与DNA的含量成正比，利用这个原理可以测定DNA的含量。（三）注意事项1.在将待鉴定的提取物加人2mol/L的NaCI溶液中溶解时，需要不断搅拌以增加溶解的DNA的量，建议搅拌3min以上。2.二苯胺试剂要现配现用，以保证实验效果。同时，加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5min以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应。四、答案和提示（一）从社会中来提示

科学家用到了限制酶、DNA连接酶、载体等“分子工具”。限制酶能识别双链DNA分子的特定核昔酸序列，并将DNA双链切断，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即催化一个DNA片段3'端的羟基与另一个DNA片段5'端的磷酸基团上的轻基连接起来形成酯键。载体上可以插入外源基因，它能携带该基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或者整合到受体DNA上，随着受体DNA同步复制。载体一般还带有标记基因，以便进行重组DNA分子的筛选。（二）旁栏思考题1.提示原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。2.不是一回事。虽然DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶，但两者存在显著的区别。（1）DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核昔酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。（三）思考·讨论1.剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.提示根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。（四）到社会中去提示

在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。（五）练习与应用概念检测1.C。2.A。拓展应用1.提示迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA人侵。2.（1）XbaI。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。（2）提示识别DNA分子中不同核昔酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核昔酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核昔酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。（六）探究·实践结果分析与评价1.提示观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。2.本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。3.提示本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。进一步探究提示

实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氣仿一异丙醇混合液（体积比为24：1），通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。教师可以根据学校的条件让学生自己设计实验方案，比较实验结果。五、背景资料（一）转基因抗病毒番木瓜的培育过程番木瓜是一种广受人们喜爱的水果，但是它的生产却一直受到番木瓜环班病毒（PRSV）的严重威胁。PRSV是一种单链RNA病毒，主要经蚜虫传播，能侵染多种葫芦科植物。病毒传播严重时，会导致番木瓜减产80%~90%。早在1928年就有人观察到，接种了烟草花叶病毒弱毒株的烟草，虽然接种叶会出现坏死斑，但整个植株获得了对同种及相近种病毒的抗性。研究发现，在其他植物中也大多存在类似的现象，人们把此现象称为交叉保护。美国夏威夷大学和康奈尔大学的科研人员于1986年开始研究培育抗PRSV的转基因番木瓜。当时科学家认为番木瓜染病是病毒外壳蛋白诱发的，于是他们根据交叉保护现象，通过基因枪法将PRSV毒株HA5-1的外壳蛋白（coatprotein，CP）基因导入了番木瓜的愈伤组织内，并于1990年获得了世界上首例转PRSV-CP基因的番木瓜。1998年4月，两个品种的转基因番木瓜在美国获准商业化种植。美国培育出的抗PRSV番木瓜品种，主要是对夏威夷地区的HA病毒株系具有抗性，对我国华南地区主要存在的四个番木瓜环斑病毒株系Ys、Vb、Sm和Lc不具有抗性。因此，我国科学家开始选用我国存在的病毒株系的基因进行转基因番木瓜研究，以期获得具有良好适应性的转基因品系。随着RNA干扰现象的发现，科学家认识到交叉保护现象主要是通过RNA介导的转录后基因沉默引起的，而不是由病毒的外壳蛋白诱导的。我国华南农业大学的科研人员利用农杆菌转化法，将病毒株系Ys的复制酶基因转入番木瓜，成功培育出转基因番木瓜“华农一号”。“华农一号”于2006年获得了生产应用安全证书，目前已在华南地区广泛种植。该品种抗性广，对华南地区流行的各种番木瓜环斑病毒毒株都具有很好的抗性，深受瓜农喜爱，产生了良好的经济、社会和环境效益。（二）限制酶简介限制酶是一类能识别双链DNA分子中特定核昔酸序列的DNA水解酶。最初，限制酶是从微生物中分离纯化得到的，而现在基本都采用基因重组的方法进行生产。20世纪60年代，阿尔伯（W.Arber）等人在研究λ噬菌体侵染大肠杆菌的机制时，发现来源于大肠杆菌K菌株的入噬菌体（简称λk）和来源于大肠杆菌B菌株的λ噬菌体（简称λa），可以高效感染它们各自的大肠杆菌宿主菌株，但是当用λk感染B菌株或用λg感染K菌株时，其感染效率大大下降，这说明λk受到了B菌株的限制，入g则受到了K菌株的限制，这一现象称作限制。科学家还发现，当用入k感染B菌株时，即便感染效率很低，也仍然有极少数的λx感染成功，如果用B菌株繁殖出来的λg再次感染B菌株，这时λx可以像λB一样高效感染B菌株，而不会出现上述限制现象，这种现象称作修饰。宿主细胞的限制和修饰作用广泛存在于细菌中。通过进一步研究，科学家弄清了细菌限制和修饰作用的分子机制。大肠杆菌K菌株和B菌株拥有不同的限制和修饰系统，它们受hsdR、hsdM和hsds基因的调控。hsdR编码产生限制酶，它能识别双链DNA分子上特定的核昔酸序列并将双链DNA分子切断；hsdM编码产生DNA甲基化酶，它催化DNA分子特定位点上的碱基的甲基化反应；hsdS编码的产物能协助限制酶和DNA甲基化酶识别作用位点。大肠杆菌细胞内的DNA甲基化酶封闭了其自身DNA上能被自身所产生，的限制酶识别的位点。λk和λg长期寄生在宿主细胞中，宿主细胞中的DNA甲基化酶也封闭了其DNA上能被宿主细胞所产生的限制酶识别的位点，所以大肠杆菌的限制酶不会降解自身的DNA以及长期在它体内生存的噬菌体的DNA。外来的DNA入侵时，宿主细胞中的限制酶会将其降解，但是这种降解作用并不完全，总有少数人侵的DNA能在宿主细胞中复制，并在复制过程中被宿主的DNA甲基化酶所修饰，这就是为什么B菌株繁殖出来的λk可以高效感染B菌株的原因。根据结构和功能的差异，限制酶可以分为三类：1型、II型、III型。Ⅰ型和II型限制酶的应用价值不大，I型限制酶广泛用于重组DNA技术。1968年，科学家首次采用硫酸按沉淀、透析、DEAE-纤维素离子交换层析等技术，从大肠杆菌K菌株中分离、纯化出了Ⅰ型限制酶。1970年，史密斯（H.O.Smith）等人将流感嗜血杆菌Rd菌株与同位素标记的沙门氏菌噬菌体P22的DNA一起解育，发现这些DNA无法通过氯化艳密度梯度离心回收，说明这些DNA被细菌中的酶降解了。接着，他们利用细菌细胞粗提物消化外源DNA，发现流感嗜血杆菌的DNA溶液黏度没有变化，说明粗提物中含有某种限制酶。（进一步，史密斯等人同样利用硫酸按沉淀、透析、DEAE-纤维素离子交换层析等技术从流感嗜血杆菌中分离、纯化出了I型限制酶HindII。他们还分析了用这种限制酶切割后的DNA的末端序列，指出这段序列是一段回文序列。自此以后，分子生物学界掀起了寻找限制酶的热潮，至今已发现3800余种限制酶。（三）磷酸二酯键在核酸中一个核昔酸核糖上第3位的羟基与下一个核昔酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合就形成了3'，5'-磷酸二酯键，它是核酸中核背酸的连接方式。若干个核昔酸通过3'，5'-磷酸二酯键连接成的多核昔酸链为核酸。在核昔酸链的一端的一个核昔酸，其核糖上第5位连接的磷酸只有一个酯键，此核昔酸被称为DNA链的5"磷酸末端或5'端；另一端的一个核昔酸上第3位的羟基是自由的，此核昔酸被称为DNA链的3'羟基末端或3'端。链内的核昔酸第5位上的磷酸和第3位上的羟基均已参与二酯键的形成，故它被称为核苷酸残基。（四）天然质粒的改造在基因工程中，人们需要对天然质粒进行改造，以获得理想、实用的载体，从而满足各种实验要求。1.基因工程中理想的载体一般至少应具备以下条件。（1）具有合适的限制酶切割位点，外源基因片段容易插入载体，插入后不影响载体进入受体细胞和在受体细胞中复制，并且载体能够保持稳定的复制状态和遗传特性。（2）容易进入受体细胞，且转化效率越高越好。（3）能在受体细胞中复制繁殖，且具有较强的自主复制能力。（4）容易从宿主细胞中分离、纯化出来。（5）有用于识别、筛选的选择性标记，便于重组DNA分子的检测。2.对天然质粒的改造主要包括以下几个方面。（1）一般载体越小，转化的效率越高；小的载体外源DNA片段的装载量更大。因此，要删除天然质粒不必要的DNA区域，尽量减小质粒的相对分子质量。（2）在质粒上引入含有多种限制酶切割位点的多克隆位点，以便外源基因的重组。一般还要删除重复的限制酶切割位点，使环状的质粒经限制酶处理后只在一处断裂，从而保证外源基因的准确插入。（3）加入易于识别的选择性标记，如各种抗生素抗性基因，以便检测重组质粒是否成功进人受体细胞。（4）为了保证实验的安全性，杜绝重组质粒扩散，污染环境，要灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌间转移的mob基因。为了提高质粒的拷贝数，还要灭活那些抑制质粒复制的基因。（5）在质粒中引入特定用途的辅助序列，以满足更多的实验要求。例如，引入Lacz基因用于蓝白斑筛选；引入用于检测和分离表达产物的标签编码序列，如多聚组氨酸标签、由8个氨基酸组成的Flag-tag标签等。（五）基因工程中载体的分类基因工程中使用的载体可以按照以下标准进行分类。1.按来源和性质分类基因工程中使用的载体按照来源和性质可以分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人造染色体载体等。质粒载体教材中已经有介绍，在这里不再展开。（1）噬菌体载体噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，噬菌体能够在宿主菌内实现复制，部分噬菌体能引起宿主菌裂解。噬菌体中首先被改造成载体的是入噬菌体。野生型的入噬菌体具有过多的限制酶切割位点，因此在改造时要去掉一些限制酶切割位点，同时切除非必需的区段。与质粒载体相比，噬菌体载体主要有以下特点。第一，噬菌体的结构更为复杂，能够携带更大的DNA片段，噬菌体可以装载5~20kb的外源DNA，而质粒一般只能携带10kb以下的DNA片段。第二，噬菌体感染细菌的效率一般要比质粒转化细菌的效率高很多，它常被用于构建DNA文库或基因组文库。第三，噬菌体的克隆操作比质粒的复杂。噬菌体和质粒作为载体各有利弊，因此人们构建了噬菌体一质粒杂合载体，该载体由噬菌体DNA的某个特征区域与质粒DNA重组而成。（2）病毒载体质粒与噬菌体都有严格的宿主选择性，只能在相应的菌体中生存和繁殖，所以它们远不能完成载体在基因工程中所承担的全部使命。动物细胞没有质粒，如果要向动物细胞导人外源基因，通常需要用到DNA病毒或RNA病毒。病毒具有高效入侵细胞的能力，能将自身的基因组转移到细胞中，掠夺细胞的“生物合成机器”生产它自己的DNA、RNA和蛋白质，因此它是功能强大的基因转移载体。动物病毒载体，如腺病毒载体、杆状病毒载体等，是比较理想的真核基因工程载体。虽然对它们的研究和应用远没有质粒那样成熟，但它们具有潜在的应用前景。（3）人造染色体载体对一些大型染色体组的序列分析往往需要克隆具有数十万甚至上百万个碱基对的DNA片段，为了满足克隆大片段外源基因的需要，科研工作者构建了人造染色体载体，如酵母人工染色体克隆载体、细菌人工染色体克隆载体等。[5.9]2.按功能和用途分类基因工程中使用的载体按照功能和用途可以分为克隆载体、表达载体、穿梭载体等。克隆载体指可以携带外源基因进入宿主细胞，并能够大量复制从而实现外源基因扩增的载体。常见的克隆质粒载体有pBR332质粒和pUC质粒。表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加了基因表达调控元件，如启动子、核糖体结合位点、终止子等，从而使得整合在它上面的外源基因能在受体细胞中高效表达。穿梭载体指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体。例如，有些载体不仅具有细菌质粒的复制起点和选择性标记，还具有真核生物的自主复制序列和选择性标记，所以它们既能在