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02四月2024高效液相色谱法01四月2024高效液相色谱法12一、

概述

高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装置高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径流动相驱动方式流动相流速150-200μm重力或低压泵很慢3-10μm高压泵快(1-10mL/min)例：分离20种氨基酸柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht分离:>20h经典柱色谱HPLCt分离：1h2一、概述高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装23二、基本理论1、色谱柱柱效的基本关系式2、分离度3二、基本理论1、色谱柱柱效的基本关系式2、分离度343、速率方程溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一43、速率方程溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散45流动相流速对板高的影响小颗粒填料，填充均匀；选择较低的流动相流速；选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：提高柱效途径5流动相流速对板高的影响小颗粒填料，填充均匀；修正的速率方程56三、高效液相色谱分离方法1、吸附色谱法分离原理Kad值越大，保留时间越长。6三、高效液相色谱分离方法1、吸附色谱法分离原理Kad值67固定相硅胶－强极性氧化铝－弱极性活性炭－非极性分子筛－强极性高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂7固定相硅胶－强极性固体吸附剂782、离子交换色谱法阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换分离原理82、离子交换色谱法阳离子交换树脂阳离子交换阴离子交换分离89固定相阳离子：－SO3H(强)－CO2H(弱)阴离子：－N+R3(强)－NH2(弱)基质合成树脂纤维素硅胶离子交换剂9固定相阳离子：基质合成树脂离子交换剂910流动相水相缓冲液+有机改性剂调节选择性的主要参数盐种类及浓度pH值各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快10流动相水相缓冲液+有机改性剂调节选择性的主要参数盐种类1011应用：离子及可离解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等11应用：离子及可离解的化合物11123、化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点123、化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳1213键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性硅烷化反应使用pH范围：2-813键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非1314键合固定相类型疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等离子交换基团胺基、季铵盐磺酸、羧酸14键合固定相类型疏水基团极性基团离子交换基团1415键合相色谱法分类

反相键合相色谱:常用固定相：C18分离对象:非极性中等极性化合物常用流动相甲醇-水乙睛-水反相键合相色谱疏溶剂分离机制固定相极性<流动相极性15键合相色谱法分类反相键合相色谱:常用固定相：C18分离1516

正相键合相色谱

固定相极性>流动相极性

离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。16正相键合相色谱离子性键合相色谱1617例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基键合相二醇基键合相17例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲1718保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸3,4-二羟基苯甲酸固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸<没食子酸18保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离18194、尺寸排阻(凝胶)色谱法排阻色谱分离示意图相对分子质量差别大于10％的化合物才可以分离分离原理194、尺寸排阻(凝胶)色谱法排阻色谱分离示意图相对分子质1920四、高效液相色谱仪20四、高效液相色谱仪2021高压泵流动相溶剂废液色谱柱进样口检测器21高压泵流动相溶剂废液色谱柱进样口检测器21221、高压输液系统高压泵要求输出压力高平稳、脉冲小流量稳定可调耐腐蚀221、高压输液系统高压泵要求2223梯度洗脱装置低压梯度高压梯度通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱23梯度洗脱装置低压梯度高压梯度2324等度洗脱与梯度洗脱24等度洗脱与梯度洗脱2425贮液瓶及流动相1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂的一般要求25贮液瓶及流动相1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生25262、进样系统

准备状态进样状态

六通阀进样装置

自动进样器

262、进样系统准备状态26273、色谱柱内径：1～6mm，柱长：5～30cm；柱填料粒径：1~5µm

分离柱273、色谱柱内径：1～6mm，柱长：5～30cm；分27284、检测系统紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器氘灯光栅流通池测量光电二极管参比光电二极管二极管阵列检测器284、检测系统紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器(2829两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器(b)(a)29两种检测器的色谱图(b)(a)2930紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长（nm）38024521221019020518730紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗