抗原抗体间的专一结合关系

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay

免疫酵素連結反應Enzyme-LinkedImmunosorbentAs1ELISA的概念抗原抗體間的專一結合關係原理與免疫染色法類似，是利用抗體的專一性去偵測抗原量的多寡，並以酵素為放大信息的標示，因此有相當高的靈敏度；因為使用固相，故操作較為方便，同時可處理大量樣本，但解析力不及電泳轉印的免疫染色法。ELISA的概念抗原抗體間的專一結合關係2ELISA的起源1959年由BersonandYellow基於生物分子抗原性，利用抗原抗體反應的專一性和高靈敏度來作生物分子的定量，並提出放射免疫分析(Radio-immunoassay,RIA)技術與理論。1967年Catt和Tregear等人首先提出以抗體吸附在塑膠管內壁來進行固定相放射免疫分析的理論，以便游離態與結合態的分離。BersonSAandYellowRSQuantitativeAspectoftheReactionBetweenInsulinandInsulinBindingAntibody.JClinInvest1959;38:1996-2016.CattKandTregearGWSolid-PhaseRadioimmunoassayInAntibodyCoatedTubes.Science1967;158:1570-1572.ELISA的起源1959年由BersonandYello3細胞體液兩種方式巨噬細胞(Macrophage)自然殺手細胞(Naturalkillercell)干擾素(Interferon)T細胞

B細胞生

產抗體兩大系統先天免疫系統後天免疫系統背景理論細體兩巨噬細胞干擾素(Interferon)T細胞生4免疫反應初級反應Primaryresponse次級反應Secondaryresponse抗原抗原時間免疫反應免疫反應初級反應次級反應抗原抗原時間免5初次入侵再次入侵初級反應次級反應記憶細胞記憶細胞抗原抗原作用細胞作用細胞初次入侵再次入侵初級反應次級反應記憶細胞記憶細胞抗原抗原6抗體抗體由四條蛋白質長短鍊所組成抗體分子上有兩個抗原結合區抗體與抗原結合是專一性的IgGImmunoglobulin抗體IgGImmunoglobulin7IgM五元體IgA二元體IgM五元體IgA二元體8抗原決定位

Epitope一個抗原分子上可能有數個抗原決定位每個抗原決定位至少誘發一種專一性抗體蛋白質性抗原決定位含有六個以上胺基酸抗原決定位

Epitope9BBB抗原MultivalentAntigen1223344一個B細胞只能生產一種抗體，對付某一抗原決定位。若有許多抗原決定位，則需許多個B細胞分別生產許多抗體。BB親和力成熟1抗原決定位BBB抗原1223344一個B細胞只能生產一種抗體，對付某一10抗原的種類蛋白質人工合成胜肽小分子稱為半抗原Hapten，需要和大分子的蛋白質載體Carrier螯合，方得進行免疫。抗原的種類蛋白質11小分子抗原的製備載體的選擇BovineSerumAlbumin,HumanSerumAlbumin,Ovalbumin,KeyholeLimiptHemocyanine等。螯合方法去除未結合部份透析小分子抗原的製備載體的選擇12螯合方法

ConjugateMethodGlutaraldehyde(GA)MethodCarbodiimide(CD)MethodMixedAnhydrideMethod螯合方法

ConjugateMethod13ConjugateMethodTypeofBondReactivegroupinhaptenutilizedforcouplingGlutaraldehydeMethodR1-NH-CH(OH)(CH2)3CH(OH)NH-R2-NH2or-COOHCarbodiimideMethodR1-CONH-R2-NH2or-COOHMixedAnhydrideMethodR1-CONH-R2-NH2or-COOHReactivegroupinhapten14GAMethodAmoxicillinGlutaraldehydeCarrierGAMethodAmoxicillinGlutaralde15AmoxicillinGlutaraldehydeAmoxicillinGlutaraldehydeCondensationPolymerization

AdditionPolymerization

H2OCarrierAmoxicillinGlutaraldehydeAmoxi16HRPN-Hydroxysuccinimide

NHS1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimideEDCAmoxicillinCDMethodHRPHRPN-Hydroxysuccinimide1-Ethy17免疫流程免疫免疫動物兔,鼠,雞,羊等免疫部位皮下,肌肉,脾內佐劑完全佐劑和不完全佐劑次數取得抗體處理儲存免疫流程免疫取得抗體18多株抗體vs.單株抗體同一個抗原決定位，可有不同的B細胞反應，因此產生不同程度親和力的抗體。或一個抗原有不同的抗原決定位，因此對一個抗原，可以有一群抗體認識它，這些抗體的親和力不一樣，所結合的抗原決定位也可以不一樣，但都對這大抗原能結合，這就是多株抗體PolyclonalAntibody。單株抗體MonoclonalAntibody是透過細胞融合技術，可以使一個B細胞變成一個融合瘤hybridoma，並使其單株化monoclonal，再篩選產生高親和力的抗體，因此單株抗體是均質性的(homogeneous)。多株抗體vs.單株抗體同一個抗原決定位，可有不同的B細胞反應19單株抗體只要細胞株存在，就可以一直生產該抗體，可以視為一種固定的試劑，不會隨著個體不同而有變化。單株抗體只含有一種抗體，無法與抗原產生免疫沈澱。單株抗體與抗原的結合部位通常只有一處，因此整體的結合力量可能不如多株抗體。單株抗體的專一性較好，且可控制所要對抗的抗原決定基位置。單株抗體只要細胞株存在，就可以一直生產該抗體，可以視為一種固20專一性反應沒有反應交叉反應+-?123AgAxyzAgB1’20

AgA’123123123專一性反應沒有反應交叉反應+-?12321AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.58123412341234多株抗體AdaptedfromMilstein(1980)S22單株抗體12341234mmmm12341234+單株抗體12341234mmmm12341234+23細胞融合

CellFusion此關鍵技術是1980年代，由Kohler與Milstein兩位科學家在英國劍橋大學所研發，往後數十年無論在基礎研究或醫學應用上都有很大貢獻，也一起獲得諾貝爾獎(1984年)。B細胞與骨髓癌細胞融合的方法。因為一般的B細胞無法在培養皿中活太久，因此不能如上述大量培養B細胞；而骨髓癌是一種淋巴癌細胞，與B細胞的背景相似，並且可以在培養皿中永久繼代下去，具有長生不死的特性。若將這兩種細胞混合，並以化學試劑PEG(polyethyleneglycol)誘導其相互融合，兩組染色體混合之後可能產生重組，當細胞分裂數次之後，染色體數目回復正常，將可能有子代細胞同時兼具分泌抗體及長生不死兩種特性，稱為融合瘤(hybridoma)。細胞融合

CellFusion此關鍵技術是1980年代24純化抗體硫酸銨AmmoniumSulfate沉澱收集約40%飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。離子交換用DEAE陰離子交換法，多用在純化IgG。膠體過濾法以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化IgM。親和層析法以ProteinA專一性地吸住IgG。純化抗體硫酸銨AmmoniumSulfate沉澱25其他產生抗體的技術選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段，再以人工方法合成出這條胜肽後，接到carrier，然後免疫產生多株抗體。因為只會對抗一段很短的蛋白質片段，有點類似單株抗體對抗抗原決定基的高度專一性，特稱之為單專一性抗體(monospecificAb)。其他產生抗體的技術選擇目標蛋白質上具有較強抗原性的一個片段，26噬菌體表現(phagedisplay)取代傳統的細胞融合方法，得到類似單株抗體的專一性探針。利用噬菌體的外殼蛋白基因為架構，插入抗體基因上與抗原結合區的部份，然後在重組後噬菌體基因庫中篩選，找出可以表現對抗原具有高專一性結合的噬菌體。將目標蛋白質的基因植在某種表現質體中，再以基因槍打入肌肉細胞中，此基因可以在體內表現出目標蛋白質，引發產生抗體或者細胞免疫。噬菌體表現(phagedisplay)取代傳統的細胞融27ELISA的原理固相免疫分析固定相種類微滴定盤(microtiterplate)亞硝基樹脂(nitrocellulose)耐龍薄膜(nylonmembrane),cellulosenitrateester(nitrocellulose;NC),polyvinylidenedifluoride(PVDF)聚苯乙烯球(polystyrenebead)及微粒子(microparticle)ELISA的原理固相免疫分析28蛋白質vs.固定相蛋白質和聚乙烯的結合為共價鍵結。50μL/well蛋白質在常溫常壓下培養2hr，每well可接上100ng，亦即300ng/cm2,4-37℃,pH6-9中進行皆可。平均1wellIgG約加入1000ng/200μL即可達飽合。蛋白質分子量與親和力成正比。蛋白質vs.固定相蛋白質和聚乙烯的結合為共價鍵結。29固定原理被動吸附廣泛應用在聚苯乙烯球，微滴定盤之ELISA分析或薄膜之免疫轉漬分析中。

共價結合常用在親水性珠子(比如agarose)。

免疫化學固定及非吸附性非共價鍵鍵結streptavidin-biotin連接或使用細菌性IgG結合蛋白，比如蛋白A。固定原理30抗原vs.抗體抗體對抗有特異性的結合(specificity),主要是靠氫鍵(hydrogenbonding)，靜電力(electrostatic)，凡得瓦爾力(VanderWaals)，及疏水性鍵結(hydrophobicforce)以非共價鍵(non-covalentbond)的方式結合。影響蛋白質構造的條件皆會影響抗原和抗体的結合(antigen-antibodybinding)溫度，離子濃度(ionicstrength)及酸鹼值(pH)抗原vs.抗體抗體對抗有特異性的結合(specificity31ELISA酵素呈色系統HorseradishPeroxidaseAlkalinePhosphatasebeta-galactosidaseGlucoseOxidaseGlucose-6-phosphateDehydrogenaseELISA酵素呈色系統HorseradishPeroxid32選擇酵素的考量纯度高催化反應轉化率高對受質專一性强價格不貴操作便利易於螯合穩定度螯合後保持活性及催化能力在樣品中無此酵素對應的受質易於製備及保存,價格低廉,有色產物易於測定選擇酵素的考量纯度高穩定度33酵素vs.受質HRPOPDO-phenylenediamineABTS2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)HPPA3-(4-hydroxy)phenlypropionicacidTMB3,3’,5,5-TetramethylbenzidineALPp-NPPp-nitrophenylphosphatePhosphate4-mehtylumbelliferonebeta-galactosidase4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside酵素vs.受質HRP34β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体内没有内源酶β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞