血红蛋白的提取和分离适合公开课

关于血红蛋白的提取和分离适合公开课（一）样品处理及粗提取1.样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。2.血浆、、杂蛋白、、柠檬酸钠、、五、生理盐水、缓慢、低速短时、上清液没有黄色3.红细胞、等、蒸馏水、甲苯、磁力搅拌器4.血红蛋白、高速离心、无、甲苯、白、脂溶性沉淀、红、血红蛋白溶液、暗红、破碎物沉淀、滤纸、脂溶性沉淀、分液漏斗、血红蛋白溶液5.无机盐离子、有机小分子、透析袋、磷酸缓冲液第2页,共29页，2024年2月25日，星期天（二）凝胶色谱操作2.交联程度、膨胀程度和分离范围、得水值、7.5、蒸馏水、均匀、气泡、磷酸缓冲液、紧密。3.管壁、凝胶面、色谱柱底部、5（三）操作提示1.白细胞2.洗脱液、沸水浴、微生物、空气3.扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序第3页,共29页，2024年2月25日，星期天请拿出课本、双色笔、导学案让我们准备好进行思维的碰撞回顾：1.凝胶色谱法和电泳的基本原理？2.缓冲溶液的作用？请3组A1阐述请5组A2阐述第4页,共29页，2024年2月25日，星期天

知识回顾凝胶色谱法分离蛋白质的原理（根据分子量的大小）相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，路程较短移动速度较快；相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。凝胶电泳的原理

带电粒子在电场的作用下发生定向迁移，在加入SDS排除电荷多少的影响后，使电泳迁移率完全取决于分子大小，从而达到分离的目的。第5页,共29页，2024年2月25日，星期天课题3血红蛋白的提取和分离

——实验操作要领知识目标：（1）描述凝胶色谱分离蛋白质的步骤；（2）理解进行样品的预处理的目的；（3）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

重、难点：（1）描述凝胶色谱分离蛋白质步骤；

（2）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

全班同学一起朗读第6页,共29页，2024年2月25日，星期天蛋白质提取和分离步骤具体操作步骤（一）（二）（三）（四）第7页,共29页，2024年2月25日，星期天哺乳血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（）90％有没有，多不多，易不易第8页,共29页，2024年2月25日，星期天1.洗涤红细胞1.1洗涤的目的：洗去血液中血浆及血小板等中的杂蛋白1.2洗涤过程：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水缓慢搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有防止破坏红细胞，使血红蛋白流失（一）样品处理黄色第9页,共29页，2024年2月25日，星期天2.血红蛋白的释放原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白第10页,共29页，2024年2月25日，星期天3.分离血红蛋白溶液分离过程：红细胞混合液离心管甲苯层脂类物质血红蛋白层破碎物沉淀层高速离心10min滤纸过滤脂类物质沉淀物烧杯分液漏斗第11页,共29页，2024年2月25日，星期天20mmol/L磷酸缓冲液透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质（二）粗分离——透析血红蛋白第12页,共29页，2024年2月25日，星期天★注意事项★（1）生理盐水作用？（3）两次离心的差异？（4）透析袋的作用机理？模拟红细胞生存环境，保持红细胞结构完整。破碎红细胞；溶解细胞膜释放血红蛋白。前慢后快，前短后长。渗透作用（2）蒸馏水和甲苯的作用？第13页,共29页，2024年2月25日，星期天（三）纯化1.凝胶色谱柱的制作（2）规格：玻璃管——长40cm，内径1.6cm，两端磨平；橡皮塞——能塞入玻璃管，上平小凹；移液管——0.5mL，长5cm；尼龙网——100目；打孔器——移液管能塞入。（1）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龙网尼龙管、打孔器、小刀、螺旋夹第14页,共29页，2024年2月25日，星期天2.凝胶色谱柱的填装（1）认识凝胶SephadexG－75

G:交联程度、膨胀程度、分离范围

75：凝胶得水值，即每克凝胶膨胀得水7.5克（3）填装：缓慢一次填装，均匀，紧密、不能有气泡，迅速连接缓冲液（2）认识缓冲液：300mL、20mmol/L、PH=7.0磷酸缓冲液第15页,共29页，2024年2月25日，星期天3.样品的加入和洗脱开下端————关下端——开下端—————加样样品完全渗入缓冲液面=凝胶面关下端————加缓冲液接洗脱瓶开下端注意：待红色的蛋白质接近柱底是，开始收集，连续收集，每管5ml疑问：连续收集得到的每一管中是否为同一分子质量的蛋白质？第16页,共29页，2024年2月25日，星期天（四）纯度鉴定—电泳1.原理：带电粒子在电场中发生定向迁移，从而把不同质量和电量的粒子分离开。加入电量远大于比粒子自身带电量的SDS，排除电荷对粒子迁移大小的影响，据此将不同分子质量的粒子分开。2.电泳结果分析如果出现一个条带：样品中含有一个分子质量级别多肽；

如果出现两个条带：样品中含有两个分子质量级别多肽。

第17页,共29页，2024年2月25日，星期天第18页,共29页，2024年2月25日，星期天第19页,共29页，2024年2月25日，星期天合作探究6分钟题目：（1）探究问题1、2、3（2）自己存在的其他疑问要求：（1）小组长搞好组织调控：先一对一讨论，再组内跨层

交流；重点讨论答案的科学性；（2）讨论形成的答案要条理清晰、要点化、序号化。帮

助展示同学做好展示准备。

A层

解决全部疑难，并帮助B层完善答案,

帮助其他同学解决疑难点。

B层

解决疑难后，负责展示。

C层

解决疑难，狂记导学案自主学习部分。第20页,共29页，2024年2月25日，星期天展示点评安排题目展示小组点评小组非展示同学探究1讨论完后B、C层落实基本原理的理解和记忆（3分钟记住）A层及时补充点评探究2探究3

点评、拓展、升华约10分钟①点评答题规范、答案的正误或全面否，进行答案的补充修正，或知识拓展，或规律方法的总结。②其他同学注意倾听、积极思考,重点内容记好笔记。有不明白或有补充的同学要大胆提出。③其它小组可进行补充点评或拓展我的舞台我做主20分钟1B24B2、5B12B1、3B16B17B28B2要求：①展示人及时到位，规范快速、脱稿。②答案要序号化、要点化。③组长搞好调控，可分工展示。④准备质疑、补充，高效科研小组成员发挥带头作用。第21页,共29页，2024年2月25日，星期天巩固反刍要求：1.B层、C层结合学习目标，巩固落实本课的基础知识；A层达成目标后，整理合作探究答案。2.组长抽查本组基础知识的掌握情况。（1）记忆凝胶色谱分离蛋白质的步骤；（2）理解进行样品的预处理的目的；第22页,共29页，2024年2月25日，星期天本堂小结本节内容目标：获取血红蛋白溶液获取红细胞（离心）破碎红细胞，释放血红蛋白从各红细胞的成分中获取血红蛋白（离心）初步纯化血红蛋白（透析）第23页,共29页，2024年2月25日，星期天1.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述正确的是（）多选

A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度ACD2.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）A.可采集猪血作为实验材料

B.用蒸馏水重复洗涤红细胞C.血红蛋白释放后应低速短时间离心

D.洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A2组A11组A2当堂反馈第24页,共29页，2024年2月25日，星期天3.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D.用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面4.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（）A.气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B.气泡阻碍蛋白质的运动C.气泡与蛋白质发生化学反应D.气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密AA5组A23组A1第25页,共29页，2024年2月25日，星期天6.下列操作正确的是（

）A.分离红细胞时采用低速长时间离心B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h5.选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是()多A.血红蛋白是有色蛋白B.红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高D.红细胞DNA含量高ABC

D4组A16组A2第26页,共29页，2024年2月25日，星期天7.下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是()多A.采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来

BCD8组A2第