粮食中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测 量子点微球荧光免疫层析法

DBXX/XXXXX—XXXXI粮食中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测量子点微球荧光免疫层析法范围本文件规定了粮食中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的量子点微球荧光免疫层析检测方法。本文件适用于大米、糙米、玉米、小麦等粮食及其制品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的快速检测。本方法检测黄曲霉毒素B1的检出限为1μg/kg，定量限为2μg/kg；检测玉米赤霉烯酮的检出限为10μg/kg，定量限为20μg/kg；检测呕吐毒素的检出限为50μg/kg，定量限为150μg/kg。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB2761食品安全国家标准食品中真菌毒素限量GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27417合格评定化学分析方法确认和验证指南术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理本方法以量子点微球为荧光标记物，基于竞争抑制免疫层析技术原理，通过荧光信号读取仪进行数据读取和分析，根据已设定的标准曲线计算样品中待测物质的含量，对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素进行半定量或定量检测。试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯水：应符合GB/T6682，二级水。黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素标准物质：纯度≥99％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。乙腈（C2H3N）。氯化钠（NaCl）。氯化钾（KCl）。磷酸氢二钠（Na2HPO4）。磷酸二氢钾（KH2PO4）。样品提取液（84％乙腈-水溶液）：吸取84mL乙腈（5.3），用水（5.1）定容至100mL，混匀。样品稀释液：分别称取氯化钠（5.4）8g、氯化钾（5.5）0.2g、磷酸氢二钠（5.6）1.44g、磷酸二氢钾（5.7）0.2g于1000mL烧杯中，加水（5.1）充分搅拌溶解后定容至1000mL。黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素标准品储存液（1g/L）：准确称取真菌毒素（5.2）0.01g（精确至0.0001g），用甲醇（5.3）溶解定容至10mL。-20℃冷冻避光保存，有效期12个月。仪器和设备分析天平：感量分别为0.01g和0.01mg。微量移液器：量程为20～200µL、100～1000µL和1～10mL。旋涡混合器：转速≥2500r/min。恒温孵育器：设定温度误差不超过±1度。荧光免疫分析仪：激发波长为360±5nm，发射波长为610±5nm。离心机：转速≥4000r/min。离心管：1.5mL和50mL。分样筛：20目。黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素量子点微球荧光免疫层析快速检测卡（含ID卡，内设对应批次标准曲线）。试样制备分样和粉碎将原始样品充分混匀，按照GB/T5491方法中的四分样方法进行分样，用粉碎机粉碎后过20目分样筛。试样前处理称取5±0.05g粉碎样品于50mL离心管中，加入25mL样品提取液（5.8），漩涡震荡混匀2min，4000rpm离心2min或静置2分钟（无离心机情况下）。检测黄曲霉毒素B1：取50µL离心后上清液加入950µL样品稀释液（5.9）混匀后用于检测。检测玉米赤霉烯酮：取50µL离心后上清液加入700µL样品稀释液（5.9）混匀后用于检测。检测呕吐毒素：取50µL离心后上清液加入700µL样品稀释液（5.9）混匀后用于检测。注：不同厂家检测卡所用的样品前处理方法可能不同，应按照产品使用说明中规定方法进行操作。检测步骤测试前打开荧光免疫分析仪（6.5），确认试剂盒中的ID卡与试剂盒的批号是否匹配后插入ID卡，在仪器测试界面点击“读ID卡/读项目”，界面出现“读取完成”，点击“确认”即可使用。将恒温孵育器（6.4）开机，待温度升至37℃即可使用。从包装铝箔袋中取出检测卡，在半小时内使用。将检测卡平放，用微量移液器吸取90μL稀释后的待测液于检测卡的加样孔（S）中，在恒温孵育器中37℃孵育反应10min。反应时间结束后立即将检测卡插入读取仪中，点击仪器界面的“测试”，仪器会自动给出定量测试结果，15min后测试无效。注：不同厂家读卡仪所用仪器界面设置可能不同，应按照仪器使用说明中规定方法进行。结果表述样品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的含量由荧光分析仪自动计算并显示，单位为微克/千克（μg/kg）。其他本方法参比标准为GB5009.209《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》和GB5009.111《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》。注：性能指标计算方法见附录A。附录A（资料性）产品性能指标计算A.1检出限和定量限通过对20个独立的空白样品进行测定，检出限以空白样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算；定量限以空白样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算。A.2准确度综合考虑目标分析物国家标准限量值或禁用目标分析物的参比方法定量限，制备低、中、高三个浓度水平的盲样，每个浓度水平进行至少6次重复实验。三个浓度水平的平均加标回收率均应在70-130%（需讨论确定）。A.3重复性采用三批验证产品进行检测，每批至少6次重复测定中等浓度水平的样品，相对标准偏差（RSD）应小于15%。A.4特异性目标分析物及其结构类似物的标准品用缓冲液配制成系列梯度浓度，做出标准曲线，得出IC50（半抑制浓度）后按照式（1）计算交叉反应率。（1）A.5假阴性率在实验条