培养细胞的生长

培养细胞的生长Steadyandcontractedbusinesssummary20183传代培养和细胞系的维持培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓的饱和密度。此时正常细胞则不再生长；恶性细胞重叠生长，易于从瓶壁上成片脱落,，为此传代势在必行。培养细胞的生长过程1）原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。2）传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis）有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。（3）衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。表皮细胞寿命4-10天；红细胞3周-3个月，白细胞5-7天，神经细胞数年或更多。密度抑制（Densityinhibition）或接触抑制（Ccontactinhibition）1958年Abercrombie等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。细胞生长曲线细胞数量生长天数缓慢生长期对数生长期平衡期

（1）迟缓期（或延迟期）当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。

（2）对数生长期：此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目迅速增长。期细胞倍增时间（TD）等于细胞周期时间（TC）长度。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。（3）平衡期（平坦期）这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。

3.1原代细胞培养的传代细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代,进行一次分离再培养称之为传一代。原代培养的首次传代是建系的关键时期，细胞需覆盖大部分瓶底后再传代。首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。3.2细胞传代方法贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞采用离心分离后传代，3.2.1贴壁细胞传代步骤吸除瓶内旧培养液；加入1ml消化液；37C或室温25C消化2~5分钟显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后；直接加少许含血清的培养液，终止消化；细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新的培养瓶内。3.2.2悬浮细胞的传代直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉1/2~1/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。离心法：离心800~1000rpm，5min，除上清，加新的培养液，然后传代接种。部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代3.3细胞系的维持是通过换液、传代和细胞冻存实现的：建立档案：记录组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。3.3细胞系的维持防细胞之间的交叉污染，传代时所用器械要编号或做好标记每一种细胞系都应有充足的冻存储备，以防绝种；另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变4.3.4培养细胞的纯化自然纯化自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势，而排除其它细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其它细胞，达到细胞纯化的目的。4.3.4.2人工纯化利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其它细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。3.4.2.1酶消化法酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,，成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。3.4.2.2机械划除法机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现，混杂生长常常分区呈片，采用机械的方法去除不需要的细胞区域，而保留需要的细胞。3.4.2.3反复贴壁法成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10~30min完成附着过程（但不一定完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞3.4.2.4克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，然后对每一克隆进行测试，选择出所需要的克隆。3