薄层层析分离方法

关于薄层层析分离方法Thin-layerchromatographyandcolumnchromatographyandaredifferenttypesofliquidchromatography.Themobile(moving)phaseisaliquid.Thestationaryphaseisusuallysilicaoralumina.Thisphaseisverypolar.Theprincipleofoperationisthesame!第2页,共88页，2024年2月25日，星期天ThinLayerChromatographyThesurfaceoftheplateconsistsofaverythinlayerofsilicaonaplasticoraluminumbacking.Thesilicaisverypolar.Thisisthestationaryphase.Spotthematerialattheorigin(bottom)oftheTLCplate.Placetheplateintoaglassjarwithasmallamountofasolventintheglassjar.Thissolventactsasthemovingphase.Removetheplatefromthebottlewhenthesolventisclosetothetopoftheplate.Visualizethespots.Non-polarcompoundswillbelessstronglyattractedtotheplateandwillspendmoretimeinthemovingphase.Thiscompoundwillmovefasterandwillappearclosertothetopoftheplate.Polarcompoundswillbemorestronglyattractedtotheplateandwillspendlesstimeinthemovingphaseandappearlowerontheplate.第3页,共88页，2024年2月25日，星期天StationaryPhase:Silica(SiO2)第4页,共88页，2024年2月25日，星期天StationaryPhase:AluminaAcidic:-Al-OHNeutral:-Al-OH+-Al-O-Basic:-Al-O-第5页,共88页，2024年2月25日，星期天

第6页,共88页，2024年2月25日，星期天Thin-LayerChromatography:ATwo-ComponentMixtureMorepolar!Lesspolar!solvent

frontoriginmixturesolvent

frontcomponent

Bcomponent

Aoriginsolvent

frontcomponent

Bcomponent

AoriginIncreasingDevelopmentTime第7页,共88页，2024年2月25日，星期天BesuretoremovetheTLCplatewhenitappearsthatthesolventfrontisn’tmoving!Reason:thesolventisevaporatingasitmovesuptheplate.Results:Ifyoudon’tremovetheplateallofthespotswillappearnearthetopoftheplate!!!!!Thisisn’taprettysightandmakesitdifficulttogetgoodRfvalues!Importanthint!第8页,共88页，2024年2月25日，星期天VisualizationMethodThepreviousslideshowscoloredspots.Mostofthetime,thespotswon’tshowunlesstheyarevisualized!VizualizationisamethodthatisusedtorendertheTLCspotsvisible.Avisualizationmethodcanbe:UltravioletlightIodinevaporstostainspotsColoredreagentstostainspotsReagentsthatselectivelystainspotswhileleavingothersunaffected.第9页,共88页，2024年2月25日，星期天Thin-LayerChromatography:DeterminationofRfValuesRfofcomponentA=dAdSRfofcomponentB=dBdSTheRfvalueisadecimalfraction,generallyonlyreportedtotwodecimalplaces第10页,共88页，2024年2月25日，星期天Thin-LayerChromatography:QualitativeAnalysis第11页,共88页，2024年2月25日，星期天1、薄层色谱：薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。第12页,共88页，2024年2月25日，星期天2仪器与材料：2.1玻板：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑，平整、洗净后的不附水珠，晾干。第13页,共88页，2024年2月25日，星期天2.2固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小，一般要求直径为10—40μm。薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10—15%煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃烘4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5—0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定展开液或缓冲液的薄层。第14页,共88页，2024年2月25日，星期天2.3涂布器：应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。2.4点样器：常用具支架的微量注射器或定时毛细管，应能使点样位置正确集中。2.5展开室：应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。第15页,共88页，2024年2月25日，星期天各种特制薄层混合薄层酸碱薄层和pH缓冲薄层络合薄层

:用AgNO3。等无机试剂的水溶液代替水调硅胶糊来铺制络合薄层

涂布固定液的薄层

高效薄层:它是由粒度十分均匀，直径最小为5µm，—般为10µm左右的硅胶吸附剂，加上高度惰性的粘合剂，铺成质地十分致密、平滑的高效高层预制板。这种预制板性能极稳定，层析展开后所得斑点仍保持圆形不拖尾，分离清晰，分离效果极好。理论塔板高度最小可达12µm，一般在20～30µm。展开3~7cm，理论塔板数可达数千，为一般薄层的十倍。

第16页,共88页，2024年2月25日，星期天第17页,共88页，2024年2月25日，星期天3操作方法：3.1薄层板制备：除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2—0.3mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。第18页,共88页，2024年2月25日，星期天3.2点样：除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2—4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。第19页,共88页，2024年2月25日，星期天3.3展开：展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为10—15cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测，如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。第20页,共88页，2024年2月25日，星期天

直线式展开

直线式展开技术可以分为近水平展开、上行展开、下行展开、双向展开和水平展开五种形式，薄层色谱分寓一般样品多采用上行展开方法。

第21页,共88页，2024年2月25日，星期天

1．近水平展开

将适量展开剂倾人长方形玻璃展开槽中，点样后的薄层板浸入溶剂0.5cm，薄层上端垫高使薄层与水平成5～10º角，展开剂由下而上进行展开，这种方法常用于不含粘合剂的软板展开．第22页,共88页，2024年2月25日，星期天2．上行展开流动相沿薄层固定相向上运动的展开方式。此时薄层板放置的角度对流动相移动速率和斑点形状有一定影响。薄层板水平角度为75º时，对展开最为有利。这种展开方式适合于含有粘合剂的硬板展开。第23页,共88页，2024年2月25日，星期天3．下行展开

在展开槽内薄层板上端放置一个盛展开剂的溶剂槽，用厚滤纸将溶剂引到薄层板的上端，使展开剂自上而下流动。下行法中展开剂受重力和毛细管作用双重影响，因此展开速度较快。由于这种展开方式采用的装置比较复杂，目前只有在葡聚糖凝胶板上展开时或纸色谱中采用．

第24页,共88页，2024年2月25日，星期天4．二维展开

在正方形薄层板上，在两个垂直的方向进行基于相同或不同机理的展开．将样品点在薄层板的一个角上，第一方向展开适当距离后，取出薄层板，并使溶剂完全蒸发，再以与原点成90º方向展开。第二方向展开可采用不同溶剂，也可将薄层板进行化学反应后，再行第二方向展开，通称双向展开.

二维展开常用于复杂较多组分样品的展开，通过调节展开剂极性，增加展开距离，进一步提高分离能力．这种方法多用于定性，很少用于定量。

第25页,共88页，2024年2月25日，星期天5．水平展开

圆形离心式展开

圆形向心式展开

特殊展开技术

:多次展开、分步展开、离心展开、梯度洗脱展开、梯度薄层、多维技术、加压展开、控温展开、楔形技术

第26页,共88页，2024年2月25日，星期天

薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。第27页,共88页，2024年2月25日，星期天4注意事项：4.1所用玻璃板应洗净不挂水珠，光滑平整。4.2铺板要均匀，厚度适宜，并于室温下晾干后在110℃活化30分钟，置于有干燥剂的干燥箱或干燥器中备用。4.3点样点一般为圆点，不能太大。

第28页,共88页，2024年2月25日，星期天铺板

铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。第29页,共88页，2024年2月25日，星期天第30页,共88页，2024年2月25日，星期天第31页,共88页，2024年2月25日，星期天点样

尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。第32页,共88页，2024年2月25日，星期天展开剂配制

选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。第33页,共88页，2024年2月25日，星期天第34页,共88页，2024年2月25日，星期天展开系统的饱和

一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。第35页,共88页，2024年2月25日，星期天(a)点状点样(b)条状点样(c)颈部点样(d)沟槽点样第36页,共88页，2024年2月25日，星期天第37页,共88页，2024年2月25日，星期天1．氨基丙酸；2．β-氨基丙酸;3．γ—氨基丁酸；4．精氨酸；5．丝氨酸；6．天门冬氨酸；7．羟基脯氨酸；8．脯氨酸；9．蛋氨酸；10．酪氨酸；11．谷氨酸；12．苏氨酸；13．甘氨酸;14．组氨酸;15．羧基赖氨酸；16．亮氨酸；17．异亮氨酸；18．赖氨酸；19．缬氨酸；20．蛋氨酸砜;21．色氨酸;22．苯丙氨酸；23．磺基丙氨酸23种氨基酸的双向层析图谱第38页,共88页，2024年2月25日，星期天温湿度的控制

温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。第39页,共88页，2024年2月25日，星期天显色方法物理显色化学显色第40页,共88页，2024年2月25日，星期天物理显色含有共轭双键的有机物质能吸收紫外光，将分离后的薄层板置于紫外灯下，组分薄层呈现暗色斑；如果采用硅腔GF(或其它含有荧光指示剂的吸附剂)铺成的薄层，在紫外光照射下，整个薄层呈显黄绿色荧光，斑点部分呈现暗色，更为明显。第41页,共88页，2024年2月25日，星期天利用蒸气熏显色时，常用的试剂有固体碘、浓氨水、液体溴。进行显色时，把这些易挥发的试剂放置在密闭容器内（例如标本瓶、标本缸、干燥器等），使它们的蒸气充满整个容器，将已展开并已挥发去溶剂的薄层板放入其中，使之显色。第42页,共88页，2024年2月25日，星期天化学显色的方式通常有直接喷雾法和浸渍法两种。

化学显色常用的显色剂剂大致可以分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。通用显色剂：对未知化合物的检测，可以考虑先用通用显色剂。这种显色剂是利用它与被测组分的氧化还原反应、脱水反应及酸碱反应等而显色的，常用的有50％的硫酸溶液、酸碱指示剂溶液、5％磷钼酸乙醇溶液、荧光显色剂等。第43页,共88页，2024年2月25日，星期天显色:喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。第44页,共88页，2024年2月25日，星期天专属性显色剂：对含有特征官能团的组分常采用专属性显色剂。薄层板喷以0.4％2,4-二硝基苯肼的盐酸溶液或盐酸乙醇溶液后，再喷0.2%的铁氰化钾的稀盐酸溶液，饱和醛、酮类有机物分别显橄榄绿色和蓝色，而不饱和羰基化合物颜色较浅或不变色。芳香族含氮化合物如生物碱等施以碘化铋钾试剂后会呈现橘红色斑点。第45页,共88页，2024年2月25日，星期天斑点组分定性、定量方法

比移值定性光谱定性各种联用检测仪器定性目视比较半定量法测量斑点面积以进行定量测定从薄层上将被测组分洗脱下来进行定量测定第46页,共88页，2024年2月25日，星期天第47页,共88页，2024年2月25日，星期天药物薄层色谱法介绍薄层色谱法，系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。

第48页,共88页，2024年2月25日，星期天1.仪器与材料(1)玻板除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格,要求光滑、平整1.仪器与材料，洗净后不附水珠，晾干。(2)固定相或载体最常用的有硅胶G、硅胶GF<[254]>、硅胶H、硅胶HF<[254]>,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F<[254]>等。其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。第49页,共88页，2024年2月25日，星期天

薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5～0.7％)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓冲液的薄层。

第50页,共88页，2024年2月25日，星期天(3)涂布器应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。(4)点样器同纸色谱法项下。(5)展开室应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。第51页,共88页，2024年2月25日，星期天2.操作方法

(1)薄层板制备除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的气泡后，倒入涂布器中,在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。第52页,共88页，2024年2月25日，星期天(2)点样除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径及点间距离同纸色谱法,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。第53页,共88页，2024年2月25日，星期天(3)展开

展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。

将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中）,密封室盖,待展开至规定距离(一般为10～15cm),取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。第54页,共88页，2024年2月25日，星期天(4)如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。第55页,共88页，2024年2月25日，星期天薄层色谱扫描仪参考价格：产地：瑞士CAMAG第56页,共88页，2024年2月25日，星期天第57页,共88页，2024年2月25日，星期天：

高效薄层分离图第58页,共88页，2024年2月25日，星期天

半自动点样仪参考价格：产地：瑞士CAMAG第59