菌落总数与大肠菌群数测定

关于菌落总数与大肠菌群数测定主要内容菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）第2页,共43页，2024年2月25日，星期天菌落总数测定掌握菌落总数测定方法实验原理 不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，36℃，48h（水产品30℃，72h），菌落数第3页,共43页，2024年2月25日，星期天菌落总数测定器材与试剂：样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，1ml吸管，培养皿第4页,共43页，2024年2月25日，星期天菌落总数测定第5页,共43页，2024年2月25日，星期天倾注培养第6页,共43页，2024年2月25日，星期天培养结果第7页,共43页，2024年2月25日，星期天菌落总数测定实验步骤

5.菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标记必要时分区计数，菌落成片者作废计算方法某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值选择菌落数在30-300之间的稀释度（1）仅有一个稀释度在此范围：菌落数×稀释倍数第8页,共43页，2024年2月25日，星期天菌落总数测定计算方法：（2）有两个稀释度在30-300之间菌落数之比>2，选较小值菌落数之比<2，取平均值（3）所有稀释度均>300

取稀释倍数最大者（4）所有稀释度均<30

取稀释倍数最小者（5）没有任何稀释度在30-300之间选最接近该范围者结果单位：CFU/ml（g）第9页,共43页，2024年2月25日，星期天菌落总数测定注意事项：

1.无菌操作

2.标记

3.何时更换吸管

4.吸吹混匀

5.琼脂培养基保温

6.安全常识第10页,共43页，2024年2月25日，星期天大肠菌群数测定实验目的实验原理

36℃，48h，产气（小倒管）三步法：初发酵、复发酵器材与试剂样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤

1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管第11页,共43页，2024年2月25日，星期天初发酵器材与试剂样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球第12页,共43页，2024年2月25日，星期天大肠菌群数测定实验步骤：

1.初发酵

第13页,共43页，2024年2月25日，星期天第14页,共43页，2024年2月25日，星期天第15页,共43页，2024年2月25日，星期天吸取样品方法第16页,共43页，2024年2月25日，星期天加注样品第17页,共43页，2024年2月25日，星期天初发酵结果右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。第18页,共43页，2024年2月25日，星期天实验步骤

3.复发酵（1）选取产气试管（2）接种至10mlBGLB肉汤中（3）培养：36℃，48h

（4）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳性。第19页,共43页，2024年2月25日，星期天大肠菌群数测定实验步骤

2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板：

45℃，无菌，倾注，15ml

（2）选产酸产气的发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养：36℃，48h第20页,共43页，2024年2月25日，星期天分离培养器材与试剂初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基第21页,共43页，2024年2月25日，星期天分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环第22页,共43页，2024年2月25日，星期天分区划线法操作要点

1.划下一个区前必须灭菌接种环

2.划线时接种环同平板呈30-40°角

3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线

4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动第23页,共43页，2024年2月25日，星期天大肠菌群数测定实验步骤

2.分离培养：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金属光泽紫黑色、无或略有金属光泽淡紫红色、中心颜色深（6）革兰染色、镜检：选特征菌落第24页,共43页，2024年2月25日，星期天革兰染色法器材与试剂结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸第25页,共43页，2024年2月25日，星期天革兰染色法涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：通过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗脱色：95%乙醇，30s或至无色为止复染：复红一滴，30s第26页,共43页，2024年2月25日，星期天涂片第27页,共43页，2024年2月25日，星期天热固定第28页,共43页，2024年2月25日，星期天初染第29页,共43页，2024年2月25日，星期天媒染第30页,共43页，2024年2月25日，星期天脱色第31页,共43页，2024年2月25日，星期天复染第32页,共43页，2024年2月25日，星期天革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性革兰染色法第33页,共43页，2024年2月25日，星期天复发酵器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管第34页,共43页，2024年2月25日，星期天大肠菌群数测定实验步骤

3.复发酵（1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液（3）培养：37℃，24h

（4）观察指标：产酸，产气第35页,共43页，2024年2月25日，星期天液体接种第36页,共43页，2024年2月25日，星期天复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生第37页,共43页，2024年2月25日，星期天大肠菌群数测定注意事项：

1.无菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.显微镜保养

5.液体接种第38页,共43页，2024年2月25日，星期天MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）目的：对某种细菌进行选择性计数核心思想：泊松分布实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值第39页,共43页，2024年2月25日，星期天MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:P(x=k)=e-x×xk/k!x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：

其中C为常系数

V为总水样量，x为细菌个数第40页,共43页，2024年2月25日，星期天MPN法原理3.当y(x)max，XMPN4.由于y(x)为单极值函数，令dy