课件速览-人干扰素α2b包涵体的处理

项目三人干扰素α2b的生产任务三人干扰素α2b包涵体的处理配制溶液，抽提包涵体，复性人干扰素α2b，超滤复性溶液，制得有活性的人干扰素α2b料液。规范填写生产记录。任务学习路径见思维导图。任务描述人干扰素α2b包涵体的处理2任务支撑（一）处理包涵体的目的与作用包涵体是外源基因在大肠埃希菌等原核细胞中高效表达，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。包涵体是非结晶、无定形的蛋白质的聚集体，以非折叠状态存在，不具有生物学活性。本任务以可逆性变性剂盐酸胍和还原剂二硫苏糖醇抽提包涵体，使人干扰素α2b溶解。再加入带有氧化性谷胱甘肽的复性缓冲液，稀释变性剂和还原剂后，人干扰素α2b从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构。超滤去除变性剂和还原剂，得有活性的人干扰素α2b。包涵体（主要位于细胞质）人干扰素α2b包涵体的处理3（二）包涵体的处理41.分离可采用离心法将包涵体从细胞破碎后的料液中分离，条件为5000～20000r/min离心15min，也可以采用过滤法分离。2.洗涤膜蛋白或膜碎片与包涵体粘连，需要洗涤去除。通常用含低浓度变性剂（如2mol/L尿素）和10mmol/LEDTA的50mmol/LTrispH7.0～8.5洗涤，也可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除。离心收集的包涵体（二）包涵体的处理53.溶解可逆性变性剂：尿素和盐酸胍等

通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白质间的氢键而增加溶其溶解度。

尿素用量为8mol/L、盐酸胍用量为6～8mol/L。去垢剂：阴离子去垢剂SDS等

破坏蛋白内的疏水键，增溶几乎所有的蛋白，但是由于SDS难以彻底去除而不可在药品生产中使用。还原剂：β-巯基乙醇（BME）和二硫苏糖醇（DTT）等

含有二硫键蛋白质的包涵体时，用于破坏二硫键。β-巯基乙醇或二硫苏糖醇一般使用浓度为20～100mmol/L（二）包涵体的处理64.复性缓慢去除变性剂和还原剂等，使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，去除还原剂使二硫键正常形成。尿素浓度4mol/L左右时复性开始，到2mol/L左右时结束。盐酸胍浓度为4mol/L时开始复性，到1.5mol/L时结束。复性效率的影响因素：复性的方法，蛋白质的浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度，以及是否存在共溶剂（如PEG6000-20000）和其他添加剂等因素影响。包涵体复性的历程变性的蛋白质复性中的蛋白质复性后有活性的蛋白质（二）包涵体的处理7（二）包涵体的处理84.复性

复性常用的方法如下：（1）超滤复性。适用于大规模生产并易于控制稀释的速度，但超滤中可能发生不可逆的变性。（2）层析法复性凝胶层析：大小不同物质间分离，变性蛋白质所处环境中变性剂浓度逐渐降低，会自发地向热力学稳定的构象状态复性。疏水层析：利用蛋白疏水性氨基酸残基与固定相表面疏水配基之间的疏水相互作用，蛋白质疏水区被瞬间结合，降低蛋白质聚集，有利于从疏水核心开始的折叠并在柱上完成复性。由于正确折叠与未折叠、错误折叠结构的疏水性不同，疏水层析复性可以得到高纯度的正确结构产物，规模放大仍可得到较高得率和纯度。（3）稀释复性。直接加入水或缓冲液，放置过夜。体积增加较大。（4）透析复性。可能形成沉淀，并且不适合放大应用于生产。（三）膜分离技术9膜分离技术以选择性透过膜（半透膜）为分离介质。当膜两侧存在某种推动力（如压力差、浓度差、电位差等）时，料液组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯目的。1.膜分离技术的特点及应用（1）无相变发生，能耗低；（2）无外加物质，节约资源，保护环境；（3）分离与浓缩同时进行，大大提高效率；（4）条件温和，适于热敏性物质的分离、浓缩；（5）设备简单，可实现连续操作，易控制、易放大；（6）适用微粒范围广泛，不仅适用于从细菌、病毒到有机物或无机物的分离，而且还适用于特殊溶液体系的分离，如共沸物的分离。

膜强度较差，使用寿命不长，易于污染

用于培养基除菌过滤和发酵无菌通气、细胞菌体收集、细胞菌体裂解液澄清、包涵体中空纤维收集/洗涤、蛋白质超滤复性、超滤浓缩/缓冲液置换、终产品超滤浓缩制剂和终产品除菌过滤等（三）膜分离技术102.膜分离技术分离机理膜分离过程的实质是大小不同的物质透过膜的能力和传递速度不同。有的物质能透过膜而有的不能透过；有的透过得快而有的透过得慢，使得膜两侧溶液组成不同，物质间实现分离。主要原理：筛分理论溶解-扩散理论唐南平衡模型优先吸附-毛细孔流动理论（三）膜分离技术113.膜分离技术分类（三）膜分离技术分离类型推动力透过物质截留物质应

用微滤压力差溶剂、溶解物等微粒、细菌料液澄清、除菌超滤压力差溶剂、离子、抗生物、有机小分子破碎细胞、微粒，蛋白质、胶体等大分子大分子物质的浓缩或去除、分离纳滤压力差溶剂、可溶性无机盐等单糖、氨基酸等可溶性有机小分子物质小分子物质浓缩、分离，料液脱盐，纯水制备反渗透压力差溶剂等各类溶解性物质超纯水制备透析浓度差低分子量物、盐离子大分子物医疗透析电渗析电位电解质（有机、无机）离子非离子化合物，大分子物质纯水制备123.膜分离技术分类（三）膜分离技术

以多孔细小薄膜为过滤介质，压力差为推动力，依据分子大小的差异将不溶性粒子（0.1-10um）分离的操作。操作压力0.05-0.5MPa。（1）微滤133.膜分离技术分类（三）膜分离技术（1）微滤微滤技术应用领域（1）微粒和细菌的过滤。水的高度净化、食品和饮料的除菌、药液的过滤、发酵工业的空气净化和除菌等。（2）微粒和细菌的检测。微孔膜可作为微粒和细菌的富集器，从而进行微粒和细菌含量的测定。（3）气体、溶液和水的净化。大气中悬浮的尘埃、纤维、花粉、细菌等；溶液和水中存在的微小颗粒和微生物。（4）食糖与酒类的精制。微孔膜对食糖溶液和酒类过滤，除菌除杂，提高食糖的纯度和酒类的清澈度，延长存放期。（5）药物的除菌和除微粒。一些液态药物，如注射液、眼药水等，必须采用微滤技术。143.膜分离技术分类（三）膜分离技术（2）超滤

以压力差为推动力，利用超滤膜表面的微孔结构对液体中溶质进行选择性分离的物理筛分过程。截留分子0.01~0.1μm，操作压0.2-0.6MPa。15蛋白质溶液超滤过程示意图恒流泵平板式超滤膜△P出背压阀△P进透出液截留液3.膜分离技术分类（三）膜分离技术（2）超滤超滤的应用蛋白、酶、DNA的浓缩脱盐/纯化清洗细胞、纯化病毒除病毒、热源163.膜分离技术分类（三）膜分离技术（3）纳滤通过纳滤膜的选择透过作用，以压力差为推动力实现物质分离(0.1-1nm)分离纳米级粒径，分离范围介于反渗透和超滤之间，能截留透过超滤膜的那部分有机小分子，透过无机盐和水。小分子量的有机物质的分离；有机物与小分子无机物的分离；溶液中一价盐类与二价或多价盐类的分离；抗生素和维生素的浓缩和纯化超纯水的制备纳滤的应用173.膜分离技术分类（三）膜分离技术（4）反渗透

利用反渗透膜选择透过性，以膜两侧压力差（静压差）为推动力，对液体混合物进行分离的过程。操作压差一般1.5～10.5MPa，截留组分为小分子物质。183.膜分离技术分类（三）膜分离技术（4）反渗透+压力193.膜分离技术分类（三）膜分离技术（4）反渗透

反渗透工业应用海水和苦咸水脱盐制饮用水制备医药、化学工业的超纯水用于处理重金属废水用于浓缩过程海水净化方案203.膜分离技术分类（三）膜分离技术（5）透析利用亲水膜，以浓度差为推动力，使高分子溶液中的小分子溶质（如无机盐）透过膜向水渗透的过程。无机盐缓冲液蛋白质、无机盐脱盐、去除变性剂、还原剂之类的小分子杂质；置换样品缓冲液；在临床上常用于肾衰竭患者的血液透析。注意：透析袋中需保留足够胀大空间透析的应用214.膜及膜组件（三）膜分离技术（1）膜的分类

根据相态：固态膜和液态膜根据断面形态结构：对称膜、非对称膜和复合膜以膜的材料种类：有机膜和无机膜（2）膜的性能膜传质需具备较好的选择透过性，可以使流体相中的一种或几种物质透过，而不允许其他物质透过，从而充分截留一些组分，又能最大限度地使另一组分快速透过。膜材料需要具有以下特性：具化学相容性生物相容性成本低耐压耐高温耐酸碱224.膜及膜组件（三）膜分离技术（3）表征膜性能的参数

主要有描述孔道特征的膜孔性能参数（孔径、孔径分布和孔隙度等）、截留率和截留相对分子质量（MWCO）、渗透通量（J）等。①描述孔道特征的膜孔性能参数孔径大小主要有最大孔径和平均孔径两个参数。孔径分布是指膜中一定大小的孔占整个孔的体积分数。孔径分布的数值越大，说明孔径分布较窄，膜的分离选择性好。孔隙率是指全部膜孔所占膜的体积分数。孔隙率的数值越大，流动阻力越小，但膜的机械强度会降低。234.膜及膜组件（三）膜分离技术（3）表征膜性能的参数

②截留率（σ）和截留相对分子质量σ：指对一定相对分子质量的物质，膜能截流的程度。影响膜截留性能的因素：分子大小、分子的结构形态、刚柔性、吸附作用等也会。膜截留率的测定：以已知分子质量的球形分子物质作为基准物（如葡萄糖MW=180，菊粉MW=5000，卵清蛋白MW=45000）进行试验。截留相对分子量（MWCO）：表示相当于一定截留率（通常为90％或95％）的分子量，作为膜的重要参数，标注于膜产品。③渗透通量

反映膜的处理能力，是指在一定条件下，单位时间内透过单位膜面积的溶剂体积，单位为m3·m-2·h-1。膜分离中，由于膜本身性质、操作因素和污染等原因，膜通量会大大降低。它是膜使用中重要控制参数。

244.膜及膜组件（三）膜分离技术（4）膜组件

膜分离装置的核心，它是由膜、支撑材料、间隔器及外壳等合理组装构成的。膜组件的结构及型式取决于膜的形状,工业上应用的膜组件主要有板框式、管式、螺旋卷式、中空纤维式等四种型式。

25结构类似于常规的板框过滤装置,膜被放置在可垫有滤纸的多孔的支撑板上,两块多孔的支撑板叠压在一起形成的料液流道空间,组成一个膜单元,单元与单元之间可并联或串联连接。板框式(Plate-and-Frame)膜组件4.膜及膜组件（三）膜分离技术（4）膜组件优点：组装方便，膜的清洗更换容易，料液流通截面较大，不易堵塞，同一设备可视生产需要组装不同数量的膜。缺点：需密封的边界线长。26内压式膜组件：膜被直接浇铸在多孔的不锈钢管内或用玻璃纤维增强的塑料管内。加压的料液流从管内流过，透过膜的渗透溶液在管外侧被收集。外压式膜组件：膜则被浇铸在多孔支撑管外侧面。加压的料液流从管外侧流过，渗透溶液则由管外侧渗透通过膜进入多孔支撑管内。管式(Tubular)膜组件4.膜及膜组件（三）膜分离技术（4）膜组件27

膜、间隔器、以及多孔的膜支撑体等通过适当的方式被组合在一起,然后将其卷绕装入能承受压力的外壳中制成膜组件。料液在膜表面通过间隔材料沿轴向流动，透过液沿螺旋形流向中心管。螺旋卷式(SpiralWound)膜组件4.膜及膜组件（三）膜分离技术（4）膜组件优点：应用广泛、与板框式相比，卷式组件的设备比较紧凑、单位体积内的膜面积大。缺点：清洗不方便，易堵塞。常用于反渗透操作28

有数百上万根中空纤维膜固定在圆形容器内构成。优点:设备紧凑，单位设备体积内的膜面积大(高达16000～30000)。缺点:中空纤维内径小，阻力大，易堵塞，膜污染难除去，故对料液处理要求高。中空纤维(HollowFiber)膜组件4.膜及膜组件（三）膜分离技术（4）膜组件295.膜分离操作技术（三）膜分离技术

膜表面附近浓度升高，增大了膜两侧的渗透压差，使有效压差减小，当操作压差一定时，过程的有效推动力将下降，使渗透通量降低。当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，紧密排列形成凝胶层，流体透过膜的阻力增大，渗透通量进一步降低。当分离含有菌体、细胞或其他固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层。（1）浓差极化浓度极化（或浓差极化）：膜分离操作中，大分子溶质被截留而在膜表面处聚积，使得膜表面上被截留的大分子溶质浓度增大。这种大分子溶质在膜表面附近浓度高于主体中大分子溶质浓度的现象。30浓差极化对膜分离的不利影响：膜面上结垢，使膜孔阻塞，逐渐丧失透过能力渗透压升高，在一定压差下使溶剂的透过速率下降，渗透通量降低溶质浓度的增加使溶质的透过速率提高，使截留率下降。5.膜分离操作技术（三）膜分离技术（1）浓差极化应对浓差极化的策略：错流操作，料液与膜面平行流动，料液的流动可有效防止和减少被截留物质在膜面上的沉积。增大流速，靠近膜的浓度边界厚度减小，会减少浓差极化的影响，有利于维持较高的渗透通量。但流速加大，膜分离能量消耗增大。315.膜分离操作技术（三）膜分离技术（2）过滤方式①死端过滤死端过滤又称正向流过滤。料液流动方向和滤膜表面垂直，根据滤膜的孔径将直径较大的颗粒物质截留，而直径较小的分子透过滤膜到滤过端。膜表面大颗粒物质不断累积易形成滤饼层，并产生浓差极化而增加过滤阻力，造成过滤压力升高、过滤速度降低。325.膜分离操作技术（三）膜分离技术（2）过滤方式②错流过滤错流过滤又称切向流过滤。过滤过程中平行于膜的切向流不断清洗冲刷膜表面，流动产生的剪切力能有效缓解膜表面滤饼层和浓差极化层的形成。避免过滤阻力快速增加，有利于维持较高的渗透通量，保持稳定的过滤流速和压力，实现更高的膜过滤处理量，延长膜寿命。336.影响膜分离的因素（三）膜分离技术（1）压力的影响膜分离的推动力：压力差△pA、当

p小,无浓度极化层,J与

p成正比;B、当

p大,有浓差极化,J的增长速率减慢;C、当

p继续增加时，形成凝胶层，且厚度随压力的增大而增大，所以J不再随

p增加。此时达到临界渗透通量

34渗透通量增加6.影响膜分离的因素（三）膜分离技术（2）温度的影响

温度料液黏度膜分离阻力温度的选择原则：在不影响料液和膜稳定性的范围内，尽量选择较高的温度。（3）其他的因素料液浓度、流速、操作时间、溶液pH、料液成分等。35膜污染：由于膜表面形成了附着层或膜孔堵塞等外部因素导致膜性能下降的现象。膜污染的标志：渗透通量下降膜污染的主要原因：微滤--膜孔被颗粒堵塞;超滤膜—浓差极化反渗透—膜对溶质的吸附和沉积作用7.膜的处理（三）膜分离技术（1）膜污染

膜污染造成膜孔堵塞，膜的渗透通量大幅度下降，膜的使用寿命缩短和影响目标产物的回收率。36膜的清洗是恢复膜分离性能、延长膜使用寿命的重要操作。清洗方法（1）物理清洗（2）化学清洗（3）物理+化学清洗7.膜的处理（三）膜分离技术（2）膜的清洗借助液体流动产生的机械力，将膜表面上的污染物冲刷掉。（1）正向清洗，采用清洗液，加大流速循环洗涤（2）反向清洗，采用空气、透过液或清洗剂反向冲洗。（3）超声波等有效地清楚因颗粒沉积造成的膜孔堵塞不能彻底洗净物理清洗37化学清洗化学试剂，对膜组件进行浸泡，并应用物理清洗的方法循环清洗，达到清除膜上污染物的目的。化学清洗剂有盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、络合剂、氧化剂和酶溶液等。eg.（1）膜表面被油污污染用热的表面活性剂溶液进行浸泡清洗。

eg.（2）蛋白质的严重吸附所引起的膜污染用蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶等）溶液浸泡后循环清洗。7.膜的处理（三）膜分离技术（2）膜的清洗38无机膜和部分有机膜--高温灭菌多数有机高分子膜--化学消毒法（乙醇、甲醛、环氧乙烷等）7.膜的处理（三）膜分离技术（3）膜的消毒与保存无菌生产时，需要对膜分离系统无菌处理一般采用浸泡膜组件的方式消毒，膜在使用前需清洗干净。如果膜分离操作停止时间超过24h或长期不用，则应将膜组件清洗干净后，选用能长期储存的消毒剂浸泡保存。一般可根据膜供应商提供的条件，科学地使用和维护膜组件，防止膜受损，延长膜的使用寿命。39任务实施人干扰素α2b包涵体的处理1234567生产前准备抽

提复

性超

滤膜系统的冲洗酸

化清

场401.确认与填写检查记录确认是否有前批清场合格证副本，确认生产环境、卫生和设备器具是否符合要求。填写发酵液中菌体的处理产前检查记录。2.领料与溶液配制（1）抽提液（1L）：母液A（pH8.2，2mol/LTris-HCl溶液）10mL、DTT3.08g、盐酸胍580g、EDTA-Na23.36g。容器标明溶液名称、浓度、配制量。4℃保存，1周内使用。（2）复性缓冲液（1L）：母液A（2mol/LTris-HCl母液）10mL、氧化性谷胱甘肽（GSSG）0.16g、尿素120g。容器上标明溶液名称、浓度、配制量。（3）稀释缓冲液（20mmol/L、pH8.2Tris-HCl缓冲液，1L）：母液A（2mol/LTris-HCl母液）10mL。容器标明溶液名称、浓度、配制量。（一）生产前准备4120℃、20min条件下，18000rpm离心抽提液。收集上清，去沉淀。测量其OD280和OD260，以及体积。计算OD280/OD260值（应大于0.8），计算OD280总量。观察抽提后上清液状态。（二）抽提2.回收包涵体称重。按抽提液体积与包涵体质量比为100mL∶5g将悬浮好的包涵体加入抽提液中。室温搅拌2h以上。1.抽提42超滤复性液，速度100～200mL/min，进液压力15～30psi

。浓缩至约5L时，停止，缓慢加入等体积稀释液后，继续超滤，反复稀释三次。浓缩至约5L时停止。3.收集包涵体将抽提后上清液缓慢倒入复性缓冲液中，同时缓慢搅拌，使之混合均匀，并在容器标明复性时间。控制复性液蛋白浓度：OD280为0.2～0.4，于4℃放置不少于12h。（三）复性用20L预冷的注射用水冲洗超滤膜包和硅胶管外壁用稀释液冲洗超滤膜包。1.清洗膜包2.超滤（四）超滤任务实施人干扰素α2b包涵体的处理43（五）膜系统的冲洗打开回液阀，同时关闭滤出阀，用缓冲液冲洗进料/回液通路侧膜上粘有的大量颗粒。冲洗5L。010204打开滤出阀，用缓冲液（或滤出液）冲洗滤出端，冲洗液直接弃去，冲洗体积为5L。用注射用水冲掉进料/回液通路中循环注射用水。03打开回液阀，同时关闭滤出阀，用注射用水循环冲洗膜的表面。冲洗时间为10min。膜系统的冲洗44（六）酸化取酸化液离心，离心条件：4℃，10000rpm，25min。离心结束后，收集上清液，测定上清液OD280、OD260并计算比值（应大于1.0）。上清液可直接进行SP离子交换层析或保存于4℃不超过24h。2.收集上清液缓慢搅拌，将冰醋酸缓慢加入超滤浓缩液中，调其pH为4.3～4.6。4℃环境中放置至少30min。1.酸化45（七）清场

检查、整理各项记录。规范地存放生产用试剂，清洗器具，维护设备，处置废物和废液，清洁、消毒工作台和洁净室。最后，填写清场合格证。注意：请在任务实施过程中规范填写《人干扰素α2b包涵体抽提操作记录》，不可补填和篡改！46知识学习反思与反馈学习成果实践操作任务实施人干扰素α2b包涵体的处理47拓展任务微孔滤膜过滤除微生物48查阅资料，了解微滤法应用于滤除微生物生产的实例。查阅设计《微孔滤膜