梅毒螺旋体抗体胶体金法检测试剂条生产工艺的优化

梅毒螺旋体抗体胶体金法检测试剂条生产工艺的优化【摘要】目的：本课题旨在对梅毒螺旋体抗体胶体金法检测试剂条生产工艺的优化进行研究，将手工生产的模式改为自动化生产。方法：原有的梅毒螺旋体（以下简称TP）胶体金检测试剂条产品是通过人工手工制作而成，现目标通过改进原有的工艺来适应和推动TP胶体金检测试剂条的自动化生产，对TP胶体金检测法试剂条的各个组分进行筛选和测试，每次实验都与原工艺作为对照组，得出各组分的最佳浓度范围和最佳生产条件，将挑选出的各组分搭配进行灵敏度和精密度测试，最终得到符合标准且能自动化生产的新工艺。结果：实验表明，T线包被的最佳浓度为0.5mg/mL，C线包被最佳浓度为1.2mg/mL，膜最佳干燥温度和时间为50℃烘箱干燥20.5h。胶体金标记液最佳浓度选择为30%，金垫最佳干燥条件为在常温干燥房中静置15±3h。样品垫最佳选择为YZ-sAb样品垫V04，将其放置在样品垫液中饱和浸泡，最佳干燥条件为60±3℃。结论：新工艺经过各个筛选实验和稳定性加速实验以及大量临床样本实验，改进生产工艺后，新的产品可以通过自动化大规模生产，且产品质量不弱于甚至强于原有的生产工艺，最大可能地节约成本且生产更加稳定更加高效。【关键词】梅毒螺旋体抗体；胶体金法；生产工艺；优化Optimizationofproductionprocessoftreponemalantibodycolloidalgolddetectionstrips[Abstract]Objective:Thisprojectaimstostudytheoptimizationoftheproductionprocessofcolloidalgolddetectionstripsfortreponemalantibodies,changethemodeofmanualproductiontoautomatedproduction.Method:Theoriginaltreponemal(hereinafterreferredtoasTP)colloidalgolddetectionreagentstripproductismadebymanualhand,nowthegoalistoadapttoandpromotetheautomaticproductionofTPcolloidalgolddetectionreagentstripbyimprovingtheoriginalprocess.ForTPcolloidalgolddetectionreagentcomponentsscreeningandtest,eachexperimentwiththeoriginalprocessasacontrolgroup,thecomponentsoftheoptimalconcentrationrangeandoptimalproductionconditions,theselectionofeachcomponentswithsensitivityandprecisiontest,finallymeetthestandardandautomaticproductionofnewtechnology.Results:ExperimentsshowedthattheoptimalTenvelopewas0.5mg/mLandCenvelopewas1.2mg/mL,andtheoptimaldryingtemperatureandtimeofthemembranewere50°Covendryingfor20.5h.Theoptimalconcentrationofcolloidalgoldlabelingsolutionwasselectedas30%,andtheoptimaldryingconditionofthegoldpadwastostandinthedryingroomatroomtemperaturefor15±3h.ThebestchoiceforthesamplepadisYZ-sAbsamplepadV04,whichissaturatedandsoakedinthesamplepadsolutionwithanoptimaldryingconditionof60±3°C.Conclusion:Aftervariousscreeningexperiments,stabilityaccelerationexperimentsandalargenumberofclinicalsampleexperimentsinthenewprocess,thenewproductscanbeproducedonalargescalethroughautomation,andtheproductqualityisnotweakerorevenstrongerthantheoriginalproductionprocess,whichsavescoststothegreatestextentandtheproductionismorestableandefficient.[Keywords]Treponemapallidumantibodycolloidalgoldmethodproductionprocessoptimization目录1前言 71.1梅毒的国内外概况 71.2梅毒的检测手段 71.3胶体金免疫层析技术发展概况及其基本反应原理 81.4胶体金免疫层析技术的优势和不足 81.5梅毒胶体金法试剂条产品现生产工艺的缺陷 91.6选题依据和目标 102实验 112.1主要材料与试剂 112.2检测原理和产品结构 112.2.1胶体金法检测TP基本原理 112.2.2胶体金试剂条的基本结构 122.2.3实验时观察指标 122.3金子浓度的选择 122.3.1确定大量标记的TP金子浓度参数 132.3.2测试所确定的金子浓度的性能 132.4T线包被浓度最佳参数 142.5样品垫的选择 152.6干燥时间的筛选 162.6.1NC膜干燥时间的选择以及性能测试 162.6.2金结合垫干燥时间的选择以及性能测试 162.6.3样品垫干燥时间的选择以及性能测试 172.7匹配浓度 182.7.1综合匹配浓度 182.7.2自动化工艺匹配浓度 192.8自动化工艺精密度和灵敏度测试 202.9自动化工艺的大量临床样本测试 212.10自动化工艺的稳定性测试 243总结 26参考文献 27致谢 291前言1.1梅毒的国内外概况梅毒是由梅毒螺旋体（treponemapallidum,TP）感染引起的一种性传播疾病[1]。梅毒患者是该疾病的唯一感染源。根据我国传染病防治法，该病被列为乙类预防和管理疾病。梅毒在世界各国的流行率都很高。根据世界贸易组织（WTO）的流行病学统计，全球每年有近1000万例新病例，主要集中在东南亚、南亚和撒哈拉以南非洲。近年来，梅毒在我国发展迅速，已成为最常见的新型性病。梅毒患者的皮肤黏膜含有梅毒螺旋体，可通过皮肤或黏膜微破损接触即可得病，极少数通过输血传染[2]。这些患者中有95%是由于无保护措施的性行为而被感染的。梅毒在早期阶段是最具传染性的，但随着疾病时间的推移，通常感染梅毒超过四年的患者通过性接触感染他人的可能性较小。通常，患者在感染梅毒螺旋体后2-3周会出现症状，表现为淋巴结肿大和硬下疳。早期症状并不明显，但随着疾病的推进，会对多个器官组织造成损害。尽早的诊疗可以控制疾病，避免病情恶化[3]。1.2梅毒的检测手段梅毒早期的传染性极强[4]，所以越早诊断越早治疗，才能更好地防范梅毒的传播。近年来，由于人们生活习惯的改变，梅毒的患病率不断升高，在梅毒早期的诊断和治疗中，最关键的是要筛选出理想的检测方法。梅毒的临床症状十分复杂，并且其病原体难以进行人工培养，所以对血清抗体的检测成为梅毒最重要的诊断依据之一[5]。在梅毒的诊断方法中，血清学检测法能够给临床提供重要依据，其中包括梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)法、酶联免疫吸附试验(ELISA）法、胶体金法等，中国疾控中心推荐梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)法作为梅毒的确证试验[6]。但是，TPPA法由于成本高昂、操作十分复杂、且无法实现自动化操作和结果判读等，所以TPPA法并不适合用于大规模筛查。而同时兼具操作简便和灵敏度较高优点的ELISA法、胶体金法，使得这两种方法更适用于大样本筛查中。但是，它们在检测中的结果表现出的特异性都较差，十分容易出现抗体假阴性的结果[7-8]。1.3胶体金免疫层析技术发展概况及其基本反应原理胶体金免疫层析技术(colloidalgoldimmunochromatographyassay,GICA)是20世纪80~90年代在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集实验、单克隆抗体技术、胶体金技术和新材料技术基础上发展而成的一种新型体外诊断技术。作为一种能够实现快速检测效果的方法，胶体金标记技术是20世纪未新兴的体外诊断技术，该方法以胶体金作为标记物，通过电镜观察对细胞或组织进行免疫学定位、定性以及定量的研究。20世纪60年代，Feldherr等首次提出胶体金作为一种用于电镜示踪标记物[9]。随后，Faulk和Taylor将胶体金应用到免疫组织学作为示踪物[10]。免疫胶体金技术作为一种新型的免疫标记技术，比传统酶联免疫标记(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等检测方法更加方便快捷，基于胶体金示踪技术的各种优势，胶体金免疫层析技术成为了当前检测发展的一个热点。近年来，随着胶体金免疫层析技术的迅速发展，其展现出巨大的检测优势，解决了实际生活中病责检测流程复杂时间长、高损耗的问题[11]。GICA具有简单快速、判定结果容易识别、灵敏度高、无污染、携带方便等优点，现已成为临床快速诊断领域的一个发展方向[12]。研究胶体金法检测梅毒螺旋抗体，优化其产品的生产工艺，有利于人们日常对梅毒的检测和监控，让有需要的患者迅速发现自身的身体情况并及时参与治疗，对梅毒的日常防控具有重要的临床意义。GICA是一种以胶体金作为示踪标志物来检测抗原抗体的新型免疫标记技术[13]。胶体金是氯金酸在还原剂(如柠檬酸、枸橼酸钠、白磷、等)的作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定状态的胶体[14]。胶体金在弱碱环境中带负电荷，能与蛋白质分子正电荷进行极其牢固地结合，并且不影响蛋白质的生物学特性。此外，由于结合物的生物学及免疫学特性，胶体金可应用在病理学、组织学、细胞生物学及免疫学等领域。1.4胶体金免疫层析技术的优势和不足胶体金免疫层析技术(GICA)拥有的优势：（1）制作成本和购买成本都很低，且整个检测过程不需要任何特殊的设备仪器；（2）检测时间短，从加样到读数整个反应过程只需要15分钟；（3）操作十分简便，适用于绝大多数场景，包括基层医院和人们日常生活中；（4）可以同时进行多个项目的检测，在样本非常难得的情况下，可以节约样本；（5）成品标志物物理性质十分稳定，并且成品可在4℃条件下贮存2年以上，另外其效价无衰减现象；（6）胶体金试剂对机体无毒害，由于胶体金本身就显红色或紫红色，在标记和反应过程中不需要加入显色试剂，省略了酶标仪的致癌性底物和终止液的步骤；（7）可以通过肉眼直接观察得出检测结果。基于以上各个优势，GICA应用在梅毒螺旋体特异性抗体的检测中，过程快速且操作简便，结果观察较为直观，无需任何特殊仪器设备，适合各种常见生活场景使用[15]。但目前胶体金免疫层析技术在应用中也有部分缺陷，在判读试纸条结果时易受到环境、标本加样量及观察时间等因素的影响，另外，当病原体检测存在交叉反应时，易导致假阴性和假阳性反应的出现，在病原多项目联合检测方面尚需提高与加强。基于此，针对以上弊端，可从提高试剂盒质量、拓宽新型标记材料、实现多项联合检测等方面进行改进，进一步提高免疫胶体金检测的敏感性、特异性，促使多元检测及直接定量检测的早日实现[16]。胶体金技术在梅毒螺旋体、衣原体、旋毛形线虫等病原体的检测中具有重要作用，据王缚鲲等[17]报道显示，以梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验（TPPA）结果为金标准，GICA检测梅毒螺旋体的准确度、灵敏度、特异度显著高于ELISA，可快速、准确诊断梅毒螺旋体的感染。1.5梅毒胶体金法试剂条产品现生产工艺的缺陷现企业中TP检测试剂条的各个组成成分以及最后的试剂条组装和装卡都是手工制作而成，包括胶体金的标记、胶体金结合垫的涂喷、样品垫的浸润和NC膜上TC线的点膜。每个工序都需要不同的人和不同的仪器来操作，首先仪器占用的面积大，然后每台仪器都需要一定的人员操作，在订单量加急的特殊情况下生产效率无法得到一定提升。另外由于是人工生产，所以无法保证所有试剂条产品都能保持一样的精密度和准确度，并且批内差和批间差有时也无法保证在合格范围内。1.6选题依据和目标根据原生产工艺的缺陷，现推动自动化生产模式的进行。自动化生产模式中，1台自动化设备可替代5台原生产仪器，且1台新设备所占面积只有3台原设备，最重要的是1台新设备只需要2个人就可操作生产；另外生产效率方面，每日的产量远超原有工艺。原工艺生产的产品在性能方面满足要求，现以原工艺配方的各个参数作为参考，调整各个成分的参数，然后用自动化机器进行生产，以原工艺作为对照进行测试，使优化后的新工艺能完全适应自动化生产。现目标是通过筛选各个成分，进行测试和调整，最终得到最优的自动化生产新工艺。新工艺所生产的产品，在精密度和准确度测试中、临床样本测试中、稳定性加速测试中皆能达到标准要求。2实验2.1主要材料与试剂实验所有试剂及耗材（见表2-1）：表2-1试剂及耗材名称规格备注NC膜M135；M140/TP包被/T线包被羊抗鼠IgG/C线包被TP结合物TP结合物01TP标记TP结合物垫进口2#玻纤/TP58/抗原通用金子稀释液01/样品垫SAB全血样品垫SAb样品垫液01标准品及指标：质控点/标准品显色指标备注P1≥C2强阳P2≥C5中阳P3C7-C5弱阳稀释1（L1）≥C31:30稀释2（L2）≥C51:300稀释3（L3）C7-C51:1500备注：质控品放在-20℃冰箱保存，使用的当天先拿出到4℃冰箱复温，使用前半个小时拿出置实验桌，使其至常温平衡。2.2检测原理和产品结构2.2.1胶体金法检测TP基本原理本产品检测原理为双抗原夹心法,胶体金结合物为标记物，进行TP抗体的检测。分别在硝酸纤维素膜（NC膜）上的检测区包被包括TP蛋白主要区段的抗原，胶体金标记同样的包含TP蛋白主要区段的标记抗原。检测时，如果样品内含有TP抗体时，样品中的TP抗体可与试纸条前端的“胶体金-抗原”结合，形成“胶体金-抗原-抗体”免疫复合物，复合物由于层析作用沿膜带移动，在T线与抗原相结合，形成“胶体金-抗原-抗体-抗原”，由于胶体金自显紫红色，此时在检测区形成一条红线，判为阳性；如样品内不含TP抗体时，检测区不会形成红色线，判为阴性。2.2.2胶体金试剂条的基本结构胶体金试剂条的结构，其构成主要有硝酸纤维素膜（NC膜），胶体金垫，样品垫，吸水纸，PVC板。（见图2-2）图2-2试剂条结构图2.2.3实验时观察指标结果观察指标：新工艺即自动化工艺为实验组，原工艺即张式材料工艺为对照组，以T线显色作为读数，通过与比色卡对照，比色卡上从颜色由深到浅读数为C1到C9，每次实验都是通过实验组与对照组的显色结果对比来判定实验组是否达到标准。2.3金子浓度的选择按照操作步骤制备用于标记蛋白的胶体金金颗粒：第一步先将超纯水加热至沸腾状态，第二步在保持沸腾状态下添加规定浓度的氯金酸并搅拌一分钟，第三步加入相应比例还原剂柠檬酸三钠，连续加热搅拌五分钟后，最后停止加热并持续搅拌冷却至室温备用[18]。胶体金颗粒制备过程中影响因素很多，如反应物的投料比、反应过程中的温度和pH值，还有反应物加入的时间等多种因素，对胶体金颗粒的制备质量都会产生影响。制备过程中使用双蒸馏水、超纯水或去离子水，保证所有玻璃器皿洁净，防止胶体金溶液制备过程中吸附于容器内壁或者发生集聚现象，影响胶体金颗粒的品质，制备良好的胶体金溶液呈现酒红色[19]。2.3.1确定大量标记的TP金子浓度参数在干燥房进行试剂条的组装，将吸水滤纸、胶体金标垫和样品垫分别粘贴至包被好的PVC板上，用切条机切条装入塑料卡壳中，压卡机压紧，即为双抗原胶体金免疫层析检测卡[20]。采用批号为2207250121的NC膜和YZ-sAb样品垫（2207130042），保证膜和样品垫不变的情况下，改变金结合物的浓度，依次使用浓度为20%、25%、30%的金子结合物，组装成三种规格的试剂条，最后到实验室滴加质控品测试，对照批号：J220523713，检测结果（如表2-3）：表2-3不同金子浓度测试质控品规格对照20%金子浓度25%金子浓度30%金子浓度P1C1+C1C1+C1+P2C4+C4+C4+C4++P3C7+C7++C6C6L1C1+C2++C1C1+L2C5C5C5C5+L3C7C7C7C7+结论：考虑到与对照较为接近，选择金浓度为30%进行喷金。2.3.2测试所确定的金子浓度的性能试剂条的组装：批号为2207250121的NC膜+YZ-sAb样品垫（2207130042）+30%的金子结合物浓度，对照批号：J220523713，检测结果（如表2-4）：表2-4浓度28%金子结合物性能测试质控品规格对照30%金子浓度P1C1+C1+P2C4+C4+P3C6+C6+L1C1C1L2C5+C5L3C7+C7+总结：金浓度为30%灵敏度符合标准，确定小试金子浓度为30%与对照较为接近。2.4T线包被最佳浓度参数（1）包被抗原用量的选择。T线、C线抗原的用量决定了其与标记复合物结合的能力，最终决定试剂的显色，T线包被抗原浓度过低会导致显色不清晰或中空的现象，T线浓度过高则可能导致C线不显色或拖带的现象。因此要对包被抗原的用量摸索验证，同时对划膜仪/点膜仪确认，并对点膜工序的各项参数验证，明确点膜速度、T线和C线的点膜量等主要参数。（2）干燥工艺。点膜后要在适宜的温度和时间内干燥，否则会造成显色不清晰、拖带、灵敏度下降等情况[21]。（3）现有3个T线包被浓度：分别是0.5mg/mL，0.6mg/mL，0.7mg/mL；另外1个已确定的C线包被浓度为1.2mg/mL；接下来实验则进行三个T线浓度的筛选。（T0.5/C1.2GXM代表T线浓度为0.5mg/mL，C线浓度为1.2mg/mL）不同条件试剂条的组装：NC膜上三种T线的参数：T0.5/C1.2GXM；T0.6/C1.2GXM；T0.7/C1.2GXM。金子结合物的参数：9#20μg/mL,30%(实验室制备）；9#20μg/mL,30%(自动化机器制备）。样品垫：YZ-sAb样品垫。滴加质控品进行测试，对照J220523713，测试结果（如表2-5，表2-6）：表2-5实验室制备金子测试组质控品规格对照T0.5/C1.2GXMT0.6/C1.2GXMT0.7/C1.2GXMP1C1C1C1+C1+P2C4+C3+C3+C3+P3C6+C6+C5C5+L1C1C1C1+C1+L2C4+C4C4+C4+L3C7+C7+C7++C7++表2-6自动化机器制备金子组质控品规格对照T0.5/C1.2GXMT0.6/C1.2GXMT0.7/C1.2GXMP1C1C1C1+C1+P2C4+C3+C3+C3+P3C6+C6+C5C5+L1C1C1C1+C1+L2C4+C4C4+C4+L3C7+C7+C7++C7++结论：T线包被浓度为0.5-0.6mg/mL时与对照较为接近。2.5样品垫的选择不同参数试剂条的组装：NC膜参数：T0.5/C1.2GXM自动化干燥24h。金子结合物参数：9#20μg/mL,30%(自动化）烘12h后；9#20μg/mL,20%(实验室）。样品垫：YZ-sAb样品垫；YZ-sAb样品垫V04。滴加质控品测试，对照：J220523713，测试结果（如表2-7）：表2-7两种样品垫的测试质控品规格对照YZ-sAb样品垫+30%金子浓度YZ-sAb样品垫V04+20%金子浓度P1C1C1C2++P2C4+C3+C3+P3C7+C6+C5+L1C2+C2++C2+L2C5C4C5+L3C7C7+C7+结论：1.YZ-sAb样品垫V04比YZ-sAb样品垫的灵敏度高0.5-1.5个色度；2.更换为V04样品垫的新工艺需要降低浓度后才能与对照条的新工艺一致；3.使用YZ-sAb样品垫V04。2.6干燥时间的筛选组成试剂条的各个成分在制作过程中都有不同的生产条件，最重要的必然是各配方浓度的参数，其次就是其使用前的最后一步干燥，不同的干燥条件生产出的材料会有不同的效果，现进行不同干燥条件的筛选。2.6.1NC膜干燥时间的选择以及性能测试参数为T0.5/C1.2GXM的NC膜干燥条件：实验室干燥24h；自动化设备干燥20.5h前段；自动化设备干燥20.5h中段；自动化设备干燥20.5h后段；自动化设备干燥22h。干燥温度为50±3℃。试剂条组装：金子结合物为9#20μg/mL,30%(自动化）烘12h后；样品垫为YZ-sAb样品垫。实验室滴加质控品测试，对照：J220523713，测试结果（如表2-8）：表2-8不同干燥条件NC膜的性能质控品规格对照实验室干燥自动化干燥20.5h前段自动化干燥20.5h中段自动化干燥20.5h后段自动化干燥22hP1C1+C1+C1+C1+C1+C1+P2C4C4+C4+C4+C4+C4+P3C6+C6+C6+C5C5C5L1C1C2++C1C1C1C1L2C4C5C4C4C4C4L3C7+C7+C7++C7++C7++C7++结论：1.干燥20.5h不同部位、22h的灵敏度差异≤0.5个色度；2.干燥20.5h前段的灵敏度比其他时间和其他部位的灵敏度差异弱。2.6.2金结合垫干燥时间的选择以及性能测试加入9#20μg/mL,30%(自动化）金子结合物的金结合垫干燥时间：烘12h前段；烘12h中段；烘12h后段；烘15h；烘18h。干燥环境：干燥房常温下。NC膜参数：T0.5/C1.2GXM。样品垫：YZ-sAb样品垫。组装试剂条，滴加质控品测试其性能，对照J220523713，测试结果（如表2-9）：表2-9不同干燥条件金结合垫的性能质控品规格对照烘12h前段烘12h中段烘12h后段烘15h烘18hP1C1+C1+C1+C1+C1+C1+P2C3C3C3C3C3C3P3C5C5C5C5C5C5L1C1C1C1C1C1C1L2C5+C4C4C4C4C4L3C7+C7++C7++C7++C7++C7+结论：自动化喷金干燥12h、15h、18h部分浓度点的灵敏度差异≤0.5个色度，确定干燥时间15±3h。2.6.3样品垫干燥时间的选择以及性能测试YZ-sAb样品垫V04的干燥条件参数：实验室常温；自动化57℃；自动化60℃；自动化63℃；自动化66℃。NC膜：T0.5/C1.2GXM。金子结合垫参数：9#20μg/mL,30%(自动化）。组装试剂条，滴加质控品测试，对照J220523713，测试结果（如表2-10）：表2-10不同干燥条件样品垫的性能质控品规格对照实验室常温自动化57℃自动化60℃自动化63℃自动化66℃P1C1C1+C1+C1+C1+C1+P2C4+C3+C3+C3C3C3P3C7C6+C6+C6+C6C6L1C2+C1C1C1C1C1L2C5C4C4C4C4C4L3C7C7+C7+C7C7C7结论：1.自动化不同温度干燥（相同干燥时间）的灵敏度差异≤0.5个色度；2.最低温度57℃和最高温度66℃的灵敏度均符合要求，且灵敏度差异≤0.5个色度；3.最终选择干燥温度为60±3℃。2.7匹配浓度2.7.1综合匹配浓度结合上述各个单成分的参数筛选，现将各个成分的浓度最优选进行搭配，筛选出最优的自动化工艺。NC膜参数选择：T0.5/C1.2GXM；T0.6/C1.2GXM。金子结合物参数选择：9#20μg/mL,20%（实验室喷金）；9#20μg/mL,25%(实验室喷金）；9#20μg/mL,30%(实验室喷金）；9#20μg/mL,12.5%，4mm(实验室涂金）；9#20μg/mL,12.5%，5mm(实验室涂金）；9#20μg/mL,12.5%，6mm(实验室涂金）。样品垫参数：YZ-sAb样品垫V04；YZ-sAb样品垫。1、喷金搭配方案：NC膜选T0.5/C1.2GXM；金子结合物选实验室喷金的三个浓度；样品垫选YZ-sAb样品垫V04，组装试剂条，滴加质控品测试，对照J220523713，测试结果（如表3-1）：表3-1喷金搭配方案测试结果质控品规格对照20%25%30%P1C1C2+C2++C1P2C3C5+C4C4+P3C7+C7+C7++C6+L1C1C2+C2++C1L2C5+C6+C6++C5L3C8+C9+C9++C72、涂金搭配方案：NC膜选T0.6/C1.2GXM；金子结合物选实验室涂金的三个规格；样品垫选YZ-sAb样品垫，组装试剂条，滴加质控品测试，对照J220523713，测试结果（如表3-2）：表3涂金搭配方案测试结果质控品规格对照4mm5mm6mmP1C1C2+C1C1+P2C3C5+C4+C3P3C7+C7+C6+C6++L1C1C2+C1C1L2C5+C7+C5C5+L3C8+C9C7C7+结论：综上上述实验结果喷金参数选择T0.5mg/mL+30%金，涂金参数选择T0.6+12.5%金5mm。2.7.2自动化工艺匹配浓度进一步筛选并确定自动化工艺的最佳参数，主要是NC膜上T线的包被浓度的最终确定。NC膜的选择：T0.5/C1.2GXM；T0.6/C1.2GXM。金子结合物：9#20μg/mL,30%(自动化）12h中卷。样品垫：YZ-sAb样品垫V04，实验室60℃干燥。组装试剂条，滴加质控品测试，对照J220523713，测试结果（如表3-3）：表3-3自动化工艺匹配质控品规格对照T0.5/C1.2GXMT0.6/C1.2GXMP1C1C1C1+P2C3C3C3+P3C6+C6+C6++L1C1C2+C2++L2C5+C6+C5+L3C7+C8+C7+结论：综上实验结果(加样量60μL/份次），包被膜匹配浓度选择T0.5/C1.2GXM符合标准要求且与对照条较为接近。2.8自动化工艺精密度和灵敏度测试经前几步筛选已初步得到自动化工艺的最佳搭配，接下来进行此新工艺的精密度和灵敏度测试。最佳搭配：NC膜：T0.5/C1.2GXM；金子结合物：9#20μg/mL,30%(自动化）；样品垫：YZ-sAb样品垫V04，自动化，60℃。测试方法：按照搭配组装试剂条；切条，切成规格宽度4mm的试剂条；装卡，使用空白长卡新通用卡（6.5CM规格PVC板），将切好的试剂条装卡；将质控品从冰箱拿出置于实验台放至保持室温平衡；加样方式：直接加样品入进样孔，加样量：血清80-100ul（3-4滴）；反应15分钟进行读数。结果（如表4-1）：表4-1精密度和灵敏度测试结果质控品规格对照自动化工艺P1C13/3C1+P2C4+3/3C3+P3C7+3/3C5+L1C2+10/10C1L2C510/10C4L3C710/10C6EL-01B+3/3C8+EL-02C9+3/3C7结论：1.灵敏度按照最新标准，均符合要求；精密度基本无差异，均符合要求。2.9自动化工艺的大量临床样本测试共收新鲜临床样本约一千五百例，包括血清样本和全血样本，但阴阳性未知，放置4℃冰箱存放。临床样本测试方法：（1）按照搭配组装试剂条成品；（2）切条，切成规格宽度4mm的试剂条；（3）取出200裸条进行装卡，使用空白长卡新通用卡（6.5CM规格PVC板），将切好的试剂条装卡；另保留1200试剂条无需装卡，放置干燥房保存；（4）根据当天任务量将相应数量的临床样本从4℃冰箱拿出置于实验台放至保持室温平衡；（5）加样方式：直接加样品入进样孔，加样量：血清80-100ul（3-4滴）；全血80-100ul（3-4滴，不上样时加一滴全血稀释液）；（6）由于检测样本量过多，需要注意反应15分钟马上进行读数，且不可超过20分钟读数。（7）检测全血样本时，若由于全血样本粘稠等原因导致样本未能在检测膜上爬升时，可适当滴加一滴全血稀释液；加完全血后若全血放置时间过长或溶血等情况会造成结果异常或实验失效。检测总结果（如表5-1，5-2）：表5-1前两批血清/血浆临床样本检测结果(仅记录阳性)临床样本序号（批次）对照自动化工艺3（一）B+C928C2C236C1C152C8C756C5C459C8C860C9C896C1C199C3+C3+102B+B+103C3+C3+111B+B+114C4+C4+129C1C2+6（二）C1C112C7C618C3C224C3C228C9C933B+C937C2C139C2C157C5+C462C9C767C1C169C2C2+74C1C176C5C4+82C9C883B+C894C1C1101C5C4103C7C6109BC9112C4C2116C7C5145C1C1146C4C3154C5C4+155C5C4156C4C4+158C5C4160C2C1163C6C6+166C6C6169C5+C4171C1C1177C9C9表5-2全血临床样本检测结果(仅记录阳性)临床样本序号（批次）对照自动化工艺70C5C6112C2++C2+123C9C9+125C3C3+小结：新工艺较对照条灵敏度显色强0.5-1个色度(共1422例样本，1287例血清/血浆，135例全血），无假阳现象，新工艺与对照条阴阳符合率都一致。通过大量临床样本测试，可知新工艺在性能和准确度完全不弱于甚至强于原工艺。2.10自动化工艺的稳定性测试对确定的新工艺的试剂条产品进行最后的加速稳定性的测试。加速稳定性测试的目的：确保产品在保质期内稳定有效且保持在一定效价范围内。测试方法：根据新工艺组装试剂条；取新工艺试剂条和对照组试剂条，切条，切成规格宽度4mm的试剂条；将新工艺组和对照组各平均分为2份，分别各取12条装入铝箔袋中，每组装7袋，共4组28袋；分组，贴上标签，分别是新工艺组中7袋常温放置，另外7袋50℃烘箱中放置；对照组中7袋常温放置，另外7袋50℃烘箱放置；标签写上放置日期，7袋分别是第1、2、3、4、6、8、10周加速实验；一周后，将标签上写着第一周的新工艺组和对照组放置50℃烘箱中的试剂条取出，放置至室温；将常温放置的新工艺组和对照组的试剂条也取出；质控品提前从冰箱取出放置至室温；试剂条装卡，进行稳定性测试；反应15分钟读数。结果指标：同组内常温与50℃加速性能测试的结果，灵敏度显色差异在一个梯度内且显色在质控标准范围内，表示此周加速实验中的产品合格；否则，判定为不合格。结果（如表6-1）：表6-1第一周加速稳定性测试结果质控品对照常温对照50℃新工艺常温新工艺50℃P1C1C1C1C1P2C4+C4+C3C3P3C6+C6C5+C5+L1C1C1C1C1L21/2C5,1/2C5+1/2C5,1/2C5+C4C4L3C7+C7+C6C6小结：对照条常温与50℃加速的灵敏度≤0.5个色度，新工艺常温与50℃加速的灵敏度基本无差异，对照条和新工艺加速第1周均符合标准要求。接下来按第一周方法进行第2、3、4、6、8、10周加速稳定性实验。其结果（如表6-2）：表6-2第2、3、4、6、8、10周加速实验测试周序小结2对照条常温与50℃加速的灵敏度≤0.5个色度，新工艺常温与50℃加速的灵敏度基本无差异，对照条和新工艺加速第2周均符合标准要求。3对照条常温与50℃加速的灵敏度≤0.5个色度，新工艺常温与50℃加速的灵敏度基本无差异，对照条和新工艺加速第3周均符合标准要求。4对照条常温与50℃加速的灵敏度≤0.5个色度，新工艺常温与50℃加速的灵敏度基本无差异，对照条和新工艺加速第4周均符合标准要求。6对照条常温与50℃加速的灵敏度≤0.5个色度，新工艺常温与50℃加速的灵敏度≤0.5个色度，对照条和新工艺加速第6周均符合标准要求。8对照条常温与50℃加速的灵敏度L2、L3相差0.5个色度，其他浓度点常温与加速≤0.5个色度，新工艺常温与50℃加速的灵敏度≤0.5个色度，对照条和新工艺加速第8周均符合标准要求。10对照条常温与50℃加速的P2和P3相差0.5个色度，其他浓度点常温与加速≤0.5个色度，新工艺常温与50℃加速的灵敏度≤1个色度，对照条和新工艺加速第10周均符合标准要求。结论：经10周的加速稳定性测试，可得出新工艺在保质期内稳定性良好。3总结本研究对梅毒螺旋体胶体金检测法试剂条的各个组分进过自动化机器生产，然后进行筛选和测试，与原工艺作为对照组，得出自动化生产中各组分的最佳浓度范围和最佳生产条件。实验表明，T线包被的最佳浓度为0.5mg/mL，C线包被最佳浓度为1.2mg/mL，膜最佳干燥温度和时间为50±3℃烘箱干燥20.5h。胶体金标记液最佳浓度选择为30%，金垫最佳干燥条件为在常温干燥房中静置15±3h。样品垫最佳选择为YZ-sAb样品垫V04，将其放置在样品垫液中饱和浸泡，最佳干燥条件为60±3℃。将挑选出的各组分参数搭配然后进行灵敏度和精密度测试，最终得到符合标准且能自动化生产的新工艺。新工艺所生产的试剂条产品，经过大量新鲜临床样本（包括血清/血浆，全血）测试，灵敏度比对照组高0-2个梯度但都在质控标准范围内，无假阳现象。在10周的加速稳定性实验中，结果显示每一周的对照条和新工艺加速均符合标准要求。综上说明新工艺无论是性能还是准确度，以及稳定性都不弱于甚至强于原工艺。自动化新工艺能够让梅毒螺旋体胶体金法检测试剂产品在大规模生产中更加高效，更加稳定，且节约大量人力物力。新工艺即将投入大规模的自动化生产中，后续需要追踪抽查大规模生产中新工艺的产品的质量。主要参考文献谭延国,韩强,田野,等.一种化学发光酶免疫分析法检测梅毒特异性抗体结果的正确解读[J].检验医学与临床,2017,14(2):153-155.肖秀美,段京京,吴思沂,等.新型冠状病毒IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测的假阳性分析[J].中华检验医学杂志,2020(43):24.赵宗瑞,刘彩霞.四种梅毒检测方法在梅毒抗体不确定样本检测中的应用效果评价[J].口岸卫生控制,2020,25(1)