葡萄籽中原花青素提取工艺优化及其对氧化损伤修复作用研究

葡萄籽中原花青素提取工艺优化及其对氧化损伤修复作用研究【摘要】目的：葡萄籽胶囊中原花青素提取工艺的优化，研究原花青素对斑马鱼体内氧化损伤的修复作用。方法:以原花青素含量为指示因子，对其萃取工艺进行响应面优化，选出最优的萃取条件；戊唑醇建造氧化应激模型，用谷胱甘肽测定试剂盒检测谷胱甘肽含量，电化学分析法检测多巴胺含量，ImageJ软件分析斑马鱼行为学，比较不同组斑马鱼体内谷胱甘肽、多巴胺含量变化及行为学参数差异，从而判断原花青素对氧化损伤的修复能力。结果：葡萄籽胶囊中原花青素的含量为682.6mg/g；空白组斑马鱼谷胱甘肽含量为359.0mg/100g，模型组斑马鱼谷胱甘肽含量为234.4mg/100g，DMSO组斑马鱼谷胱甘肽含量为328.4mg/100g，原花青素低浓度组（1mg/L）斑马鱼谷胱甘肽含量为255.0mg/100g，中浓度组（1.5mg/L）谷胱甘肽含量为268.1mg/100g，高浓度组（3mg/L）谷胱甘肽含量为307.3mg/100g。空白组斑马鱼多巴胺含量为4205.0ng/g，模型组斑马鱼多巴胺含量为4543.7ng/g，DMSO组斑马鱼多巴胺含量为4139.2ng/g，低浓度组斑马鱼多巴胺含量为4294.5ng/g，中浓度组斑马鱼多巴胺含量为4301.2ng/g，高浓度组斑马鱼多巴胺含量为4298.5ng/g，三个浓度组多巴胺均低于模型组，且与空白组相近；三个浓度组与空白组静止时间及移动距离相近，模型组静止时间显著低于其他组，移动距离高于其他组。结论：由上述结果可得葡萄籽原花青素对斑马鱼体内氧化损伤具有一定的修复作用。【关键词】葡萄籽胶囊；原花青素；提取工艺；氧化损伤Optimizationofproanthocyanidinextractionfromgrapeseedanditsrepaireffectonoxidativedamage【Abstract】Objective:OptimizationoftheExtractionProcessofProanthocyanidinsfromGrapeSeedCapsulesandStudyontheRepairingEffectofProanthocyanidinsonOxidativeDamageinZebrafish.Methods:Usingtheoriginalanthocyanincontentasaindicator,theextractionprocesswasoptimizedusingresponsesurfacemethodologytoselecttheoptimalextractionconditions.Azebrafishoxidativestressmodelwasestablishedusingtebuconazole,withglutathioneassaykitusedtomeasureglutathionecontentandelectrochemicalanalysisusedtodetectdopaminecontent.ImageJsoftwarewasusedtoanalyzezebrafishbehavior,anddifferencesinglutathioneanddopaminecontentchangesaswellasbehavioralparameterswerecomparedbetweendifferentgroupsofzebrafish,Thus,therepairabilityofproanthocyanidintooxidativedamagewasevaluated.Results:Thecontentoforiginalanthocyaniningrapeseedscapsulesis682.6mg/g.Theglutathionecontentintheblankgroupofzebrafishis359.mg/100g,whiletheglutathionecontentinthemodelgroupofzebrafishis234.4mg/100g,andintheDMSOgroupis328.4mg/100g.Inthelowconcentrationgroupoforiginalanthocyanin(1mg/L),theglutathionecontentinzebrafishis255.mg/100g.Inthemediumconcentrationgroup(1.5mg/L),theglutathionecontentis268.1mg/100g.Inthehighconcentrationgroup(3mg/L),theglutathionecontentis307.3mg/100g.Thedopaminecontentintheblankgroupofzebrafishis4205.ng/g,whilethedopaminecontentinthemodelgroupofzebrafishis4543.7ng/g,andintheDMSOgroupis4139.2ng/g.Inthelowconcentrationgroupofzebrafish,thedopaminecontentis4294.5ng/g,whileinthemediumconcentrationgroup,itis4301.2ng/g,andinthehighconcentrationgroup,itis4298.5ng/g.Thedopaminecontentinallthreeconcentrationgroupsislowerthanthemodelgroupandsimilartotheblankgroup.Thestatictimeandmovingdistanceofthethreeconcentrationgroupsaresimilartotheblankgroup,whilethemodelgrouphasasignificantlylowerstatictimeandhighermovingdistancethanothergroups.Conclusion:Accordingtotheaboveresults,grapeseedproanthocyanidinshaveacertainrepaireffectonoxidativedamageinzebrafish.【Keywords】GrapeSeedCapsulesProanthocyanidinExtractiontechnologyOxidativedamage目录1前言 前言原花青素(Procyanidins,PC)，也称原花色素，是一种生物类黄酮，通常是红褐色粉状，气微、味湿,溶于大多表面活性剂,是在植物中普遍生存的一大类多酚类化合物的统称，是一个良好的自由基清除剂和类脂肪过氧化抑制剂。从分子结构上,原花色素中最基本的成分为儿茶素、表儿茶素、以及儿茶素与表儿茶素形成的二聚体（图1），其次为三聚体、四聚体等甚至十聚体[1]。按聚合度的大小，通常将二-五聚体称为低聚原花青素（Procyanidolicoligomer，OPCs），将五聚体以上的称为高聚原花青素[2]（(Procyanidolicpolymers，PPCs）。注：n=2-4称为低聚原花青素，n>=5称为高聚体图1原花青素基本结构葡萄籽中原花青素种类丰富，是一种有效的抗氧化剂，可以有效的防止脂质的氧化和自由基的攻击，保护人体免受氧化的损害，但由于其性质不稳定，不同的提取方法会对提取率和质量产生影响[3]，因此，提取工艺是影响原花青素得率的重要因素，提取方法主要有酶提取法、超临界CO2提取法等[4]，杨亚超等人利用超声辅助萃取法，紫外-分光光度法，对葡萄籽原花色素进行了分析，并用显色反应ABTS法对葡萄籽原花色素进行了研究[5]；李瑞丽等人采用响应面优化法，所得到的最佳提取条件为：提取温度70℃，乙醇浓度60%，提取时间为60min[6]；原花青素含量的测定方式也有多种，包括盐酸-正丁醇法、间接原子吸收法、电化学法、HPLC法[7-8]等，最常用的是盐酸-香草醛法[9]来测定原花青素的含量。原花青素有多种功能，在化妆品中运用提供了新思路[10]，具有美白祛斑、抗皱、防晒、保湿等功效，显著的抗癌[11]，抗氧化抗衰老作用[12]，另外还有研究表明它可以抗心肌缺血再灌注损伤，其发挥抗动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作用[13]是通过抑制低密度脂蛋白氧化，有着广泛的药理活性及安全性[14]；高渊等人[15]发现OPC可通过其代谢物PCA发挥血管舒张功能保护作用，原花青素也能改善氧化损伤[16]，其含有数个酚性羟基，在机体内被氧化产生氢离子，这些氢离子与自由基或氧化物结合，从而避免脂质发生氧化[17]；氧化损伤指的是在细胞的氧化应激过程中自由基水平与细胞的抗氧化能力之间的氧化还原失去平衡，使得细胞抗氧化能力的相对不足，一些具有高毒性的活性氧自由基增多，从而导致细胞和组织的损伤，活性氧基团（ROS）的过量生成及抗氧化防护体系的破坏也是导致上述发生的重要原因，补充抗氧化剂可能有助于预防或缓解神经退行性疾病。原花青素抗氧化作用的机制是通过增强肝细胞的抗氧化酶活性，降低脂质过氧化，并清除自由基来实现的，并且肝脏是生物代谢主要器官，其中谷胱甘肽含量丰富，毒害后会出现明显反应，谷胱甘肽（GSH）是一种低分子清除剂，对于动植物而言，它是一种多功能的抗氧化肽，在体内普遍存在并且用于抵抗氧化损伤[18]，可以清除O2、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是一种由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸构成的三肽，它是人体组织中一种重要的非蛋白合成物质，同时也是GSH-PX和GST两种酶的底物，是这两种酶对氢过氧化物进行降解的必要物质，近年来，研究表明，谷胱甘肽还可以促进维生紊E还原为还原状态，可能与加重氧化损伤有关，因此，谷胱甘肽的含量是评价人体抗氧化能力的一个重要指标[19]，其测量方法有比色法、HPLC法、荧光法等。氧化应激也是多巴胺能功能细胞神经紊乱的重要原因[20]，多巴胺是大脑中含量最高的一种儿茶酚胺类神经递质，作为神经递质调控中枢神经系统的多种生理功能，特别是对运动控制起到重要作用[21],其含量与神经系统健康与否密切相关，因此多巴胺含量的多少是检测机体神经损伤程度的重要因素，检测多巴胺含量的方法有HPLC法、液相质谱联用和电化学分析法[22]。关于体内氧化损伤的研究对象，陈晨[23]研究发现斑马鱼是一种常见的神经科学模式生物，它拥有与人类类似的神经发育等特征，斑马鱼和人类的基因有着70%的同源性，且84%的人类疾病相关基因都能在斑马鱼组织中找到，作为主要模式生物之一被广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学和药物筛选等科研领域[24]，所以在对斑马鱼做出的实验结果也多适用于人体，可用于药物恢复性的研究及筛选；TaoHuang[25]等人发现三唑类药物对斑马鱼的线粒体氧化磷酸化受损和氧化应激，以及脂质代谢失调具有影响，这种代谢紊乱会导致斑马鱼发育迟缓、畸形和异常的运动情况；氧化损伤后导致斑马鱼的神经损伤也会影响其运动轨迹，Sharma等人以神经系统毒性角度探究[26-28]斑马鱼运动轨迹所受影响，JuliaCanzian等人[29]通过对斑马鱼行为学的检测来判断斑马鱼神经受损的程度，斑马鱼行为学检测软件有斑马鱼行为轨迹跟踪系统及ImageJ。因此本实验以斑马鱼为研究对象，戊唑醇建造氧化应激模型，DMSO为万能溶剂溶解原花青素，用比色法检测各组斑马鱼体内谷胱甘肽含量，电化学分析法检测多巴胺含量变化以及ImageJ检测行为学差异，研究原花青素对体内氧化损伤的修复作用，为原花青素在动物体内实验上提供实验参考，为原花青素的进一步开发提供了理论基础。2试剂与仪器2.1实验试剂本实验所用实验试剂如表1所示：表1试剂的规格及厂家试剂规格生产厂家葡萄籽胶囊300颗/盒澳大利亚HealthyCare公司戊唑醇粉末5g拜耳股份公司儿茶素标准品20mg对照品实验耗材中心谷胱甘肽试剂盒100T/96样南京建城生物工程研究所香草醛100g南京建城生物工程研究所浓盐酸分析纯广州化学试剂厂无水乙醇分析纯广州化学试剂厂甲醇分析纯天津市大茂化学试剂厂DMSO（二甲基亚砜）分析纯天津市科密化学试剂有限公司去离子水广东药科大学2.2实验仪器本实验所用实验仪器如表2所示：表2仪器的型号及厂家仪器型号厂家电子分析天平ML-204梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司数显恒温水浴锅HH-1天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂烘箱ST-01佛山市顺德区柏昊金属制品有限公司紫外分光光度计UV-1750日本岛津公司离心机TD-WS/55湖南平凡科技有限公司电化学工作站CHI660E/CH上海辰华仪器有限公司反渗透纯水设备CDLF1广州市滤博水处理科技有限公司2.3实验动物Tubingen品系斑马鱼，购于南京-树梨花生物有限公司3实验方法3.1原花青素提取条件的优化3.1.1单因素试验以原花青素为评价对象，考察了乙醇浓度、萃取时间和萃取温度对萃取率的影响。（1）溶剂浓度的影响在圆底烧瓶中准确称取4份葡萄籽粉各0.1g，向其中加入浓度为20%，40%，60%，80%的乙醇溶剂10mL,在60℃水浴恒温提取60min,过滤后用乙醇定容至50mL[30]；（2）提取温度的影响在圆底烧瓶中准确称取4份葡萄籽粉各0.1g，向其中添加10mL60%的乙醇，水浴恒温分别为30℃,50℃,70℃,90℃提取60min,过滤之后用乙醇定容至50mL[30]；（3）提取时间的影响在圆底烧瓶中准确称取4份葡萄籽粉各0.1g，向其中加入10mL60%的乙醇溶剂，水浴恒温提取60min，80min,100min,120min,过滤后用乙醇定容至50mL[30]；香草醛-盐酸法测定含量：将上述滤液0.4mL，添加2.4mL4%香草醛甲醇溶液，并将其混合均匀，之后再加入1.2mL浓盐酸，将其完全混合均匀，在室温下进行显色15分钟，在500nm波长下进行吸光度的测定[31]。3.1.2响应面分析法优化原花青素提取根据响应面分析法的原理，通过单因素的实验，对提取时间、提取温度和乙醇浓度优选三个水平[32]，采用响应面分析法优化提取条件，结果见表3。表3响应面试验影响因素水平与编码水平水平及编码-101A乙醇浓度（%）204060B提取温度（℃）305070C提取时间（min)801001203.2原花青素的含量测定记录制作标准曲线精确称取10mg的儿茶素标准品，放入烧杯中，加乙醇溶解后转移至10mL容量瓶中，用乙醇定容。分别量取1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL和3.5mL原花青素标准品溶液于25mL容量瓶，用乙醇定容，量取上述5个浓度的标准品溶液各0.4mL置于试管中，向试管中加入4%香草醛甲醇溶液2.4mL和浓盐酸1.2mL，再取0.4mL乙醇溶液加入4%香草醛甲醇溶液2.4mL和浓盐酸1.2mL作为空白对照。摇晃均匀后进行遮光处理，将上述反应完成的溶液，在500nm的波长下测定上述反应的吸光值，将吸光度做为y轴，x轴为儿茶素标准品浓度制作标准曲线。用盐酸-香草醛法去测定原花青素的含量，将优化提取工艺后得到原花青素吸光度，葡萄籽原花青素的含量用下列公式去计算：Y1=v×x×n其中：Y1为提取物中原花青素总量，mg/g；v为提取液体积，mL；x为提取液浓度，mg/mL；n为提取液稀释倍数；m为葡萄籽粉末质量g。3.3氧化损伤模型的建立3.3.1戊唑醇浓度的确定取50条斑马鱼，分5组放入培养皿中，每组10条斑马鱼于0.5L溶液，分别置于戊唑醇浓度为0、0.5mg/L、0.7mg/L、1mg/L、2mg/L。暴露48h后记录每组的死亡个体数，将致死数为0的戊唑醇浓度就作为模型组中戊唑醇浓度。3.3.2斑马鱼行为学的测定空白组与模型组培养四天后分别取5条斑马鱼，依次放入培养皿中，待其适应培养皿环境2-3分钟后，拍摄视屏长度为2min的动作捕捉画面。使用ImageJ运动跟踪软件以每秒25帧的速度测量游泳活动，在预定义的场地内捕捉游泳动作(一个场地对应一个孔洞，内径约为120毫米)[33]。对每个动画文件设置检测变量，以保证对所有斑马鱼的最佳检测。随后，使用ImageJ软件对数据进行分析，并提供斑马鱼的移动距离与静止时间，以表征每个个体的游泳活动。将得到结果与对照组进行对比，记录实验数据。3.3.3多巴胺的含量测定将斑马鱼头部剪下，使用眼科剪沿着脊柱像斑马鱼两眼之间剪开，暴露出脑组织，使用解剖针将脑组织从中分离后置于放有生理盐水的离心管中。将已放入脑组织的离心管放进35摄氏度的恒温水浴，保证组织的活性，放置待用。从离心管中取出制得的斑马鱼脑组织，用冰盐水漂洗，吸水纸吸干，称重记录数据后放入研磨钵中，加入适量的人工脑脊液，用手在冰水浴中进行5min的研磨，将匀浆液装入1.5毫升离心管内，以2500rpm/min离心10min，取出上清液以做检测。取1mL上述步骤制得的脑组织上清液于烧杯中，再加入19mL的人工脑脊液，将溶液混合均匀，等待测定。使用CHI660E电化学工作站，采用饱和甘汞电极参比电极、铂片对电极、制得的修饰碳纤维电极作为工作电极，使用差分脉冲伏安法(DPV)作为测定方法[34]，在起始电压为−0.3，终止电压为0.6V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为0.2s，脉冲周期为0.5s的条件下测定，记录峰高。实验最佳条件下，在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中，调节扫描速率为10mv/s,从-0.4v—0.6v之间进行扫描，以纵坐标为多巴胺浓度，横坐标为峰电流大小建立多巴胺含量标准曲线，电流单位为A，浓度单位为ug/L。按下列公式计算斑马鱼脑组织中多巴胺含量。斑马鱼脑组织中多巴胺含量=溶液中多巴胺浓度3.3.4谷胱甘肽的含量测定斑马鱼的解剖（见图2）：将斑马鱼放入装有冰水混合的烧杯中20分钟左右，直到斑马鱼静止不动。将其置于泡沫板上，用针插入眼部及尾部固定，剪开腹部并取出内脏团，将其放入洗净并滴有几滴生理盐水的表面皿中，使用解剖针及镊子将肝组织从中分离出来，分离出的肝组织置于加入生理盐水的离心管内。图2斑马鱼解剖示意图斑马鱼组织匀浆的制备：从离心管中取出所得的斑马鱼组织，用冰盐水漂洗后吸水纸吸干，称重记录数据后放入研钵中，加入适量的匀浆递质，手动研磨5分钟使组织匀浆化。在2500转/分下，将该匀浆液注入1.5ml的离心管中离心10min，取上清液进行测定。制备上清液后进行显色反应，然后进行谷胱甘肽含量计算（按标准曲线法查表）。标准曲线溶液按按表4进行配制。表4谷胱甘肽标准曲线溶液配制稀释管123456标准品溶剂应用液（uL）10008006004002000100umol/L标准溶液（uL）02004006008001000标准品浓度（umol/L）020406080100用稀释后的谷胱甘肽标准溶液，按照操作表，将空白管调零，420nm处，用1厘米的光学直径，测量每一管吸光度，用标准品的浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，做标准曲线。谷胱甘肽质量/肝重量（mg/100g）=浓度x2.55x12.75x307x3.4氧化损伤修复作用的研究斑马鱼给药：将斑马鱼分6组，每组别放入10条受试斑马鱼，每组溶液为1000mL，其中四组加入一定量的戊唑醇，一组加入浓度为1%的DMSO溶液，另一组加入去离子水，每两天更换一次，周期为四天。将6组鱼分别称为空白组、DMSO组、模型组、低浓度组（1mg/L）、中浓度组（1.5mg/L）和高浓度组（3mg/L）；空白组，DMSO组及模型组继续喂养斑马鱼，其余组置于戊唑醇溶液中，每组溶液均为1000mL，每两天更换一次，给药周期为七天。按“3.3.2斑马鱼行为学的测定”在第十一天检测斑马鱼行为学，“3.3.3多巴胺的含量测定、3.3.4谷胱甘肽的含量测定”在第十二天检测谷胱甘肽及多巴胺含量。4结果与分析4.1单因素试验根据提取温度、时间、乙醇浓度对原花青素含量的影响作图，结果如图3所示。ABC注：A.提取时间影响图；B.温度影响图；C.乙醇浓度影响图图3各种单因素对葡萄籽原花青素含量的影响由图3(A)可知，提取时间为100min时葡萄籽原花青素含量最高，原花青素含量随着时间的增大而逐渐减少，故选择时间为100min为最佳提取时间。由图3(B)可知，在50℃时葡萄籽原花青素含量最高，随着温度的上升而逐渐减少，故选择50℃为最佳提取温度。由图3（C）可知，原花青素含量随着乙醇浓度的升高先上升后下降，在40%时达到最高，可能是因为随着乙醇体积分数的增加，其对氢键破坏能力增大，而水对其渗透力减弱，因此随着乙醇体积分数增大会导致原花青素的含量减小。故确定40%乙醇为最佳提取浓度。4.2响应面分析法优化原花青素的提取4.2.1响应面试验结果及分析在单因素的基础上，采用响应面方案进一步试验。结果见表5。编号No.A提取温度/（℃）B乙醇浓度/%C提取时间/（min）原花青素含量/（mg/g923020100493.137060100551.845040100669965040100682.677020100522.585040100671.395040100680.4105020120524.7115040100684.9127040120603.713506080567.6145060120630.715502080529.2163060100574.317704080592.4表5响应面实验方案及结果4.2.2响应面数学模型的建立与显著性检验用DesignExpert10分析软件建立方程:Y=0.3938+0.0010A+0.0141B+0.0044C-0.0057AB+0.0003AC-0.0075BC-0.0244A^2-0.0387B^2-0.0122C^2；由模型的“P值”＜0.0001可知该回归方程模型达到了较为显著的水平，可靠性较高；决定系数R2=99.17%；失拟项>0.05,不显著，说明拟合度较好；综上，该模型可用于预测最佳提取条件。注：R2=0.9917,RAdj2=0.9811,RPred2=0.9122；CV%=1.07<10。P<0.05,差异显著，P<0.014.2.3单因素交互作用及葡萄籽原花青素提取验证试验由DesignExpert10分析软件得到最佳提取条件为温度49.959℃，乙醇浓度为44.124%，提取时间为104.872min。各单因素交互作用的等高线及响应面曲面图见下图4-6。图4提取温度和乙醇浓度对原花青素含量的等高线及响应面曲面图图5提取温度和提取时间对原花青素含量的等高线及响应面曲面图图6提取时间和乙醇浓度对原花青素含量的等高线及响应面曲面图由图4-图6可知，响应面曲面的陡峭度大小顺序为AB>BC>AC,且等高线均呈椭圆形，表明乙醇浓度和提取温度、提取温度和提取时间、乙醇浓度和提取时间的交互作用对原花青素得率影响显著，与方差分析结果一致。4.3原花青素含量测定结果儿茶素标准曲线见图7，相关系数r=0.9958。图7儿茶素标准曲线代入3.2中公式可得最佳提取条件下葡萄籽原花青素含量为682.6mg/g。4.4氧化损伤修复作用测定结果与分析4.4.1氧化应激模型的建立表6戊唑醇给药浓度及其致死率戊唑醇浓度（mg/L）00.50.712死亡数量（条）004710致死率（%）004070100如表6所示，当戊唑醇浓度为0.5mg/L死亡数量为0，致死率为0。脑组织按照“3.3.3多巴胺的含量测定”方法建立标准曲线及含量检测，标准曲线见图8，相关系数r=0.9957。图8多巴胺含量标准曲线注：*与空白组相比，p＜0.05，差异显著图9模型组与空白组多巴胺含量柱状图如图7及图9所示，当戊唑醇浓度为0.5mg/L，模型组斑马鱼脑中多巴胺含量高于空白组;肝组织按照“3.3.7谷胱甘肽的含量测定”方法建立标准曲线见图10，相关系数r=0.9987；计算得出谷胱甘肽含量见图11.图10谷胱甘肽标准曲线注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;**与空白组相比，差异显著；p<0.01，差异高度显著；***与空白组相比，p<0.001，差异极显著图11空白组与模型组谷胱甘肽含量柱状图如图11所示，当戊唑醇浓度为0.5mg/L时，模型组谷胱甘肽含量低于空白组；图12斑马鱼运动轨迹（b）注：**与空白组相比，差异显著。图13空白组与模型组斑马鱼行为学参数如图12、图13所示，图13（a）中可看出模型组斑马鱼运动距离高于空白组，（b）中可看出静止时间低于空白组；由此可得模型组使斑马鱼运动行为增强。综上所述，本实验可使用0.5mg/L的戊唑醇建造氧化损伤模型。4.4.2多巴胺含量测定结果将六组斑马鱼解剖后，多巴胺浓度与峰电流关系见图14；多巴胺含量测定结果见图15。图14多巴胺浓度与峰电流关系注：ns与空白组相比，p>0.05,差异不显著；*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著图15不同组多巴胺含量柱状图由图15可得DMOS组与空白组差异不显著，说明DMSO组对实验的影响可忽略；模型组多巴胺含量较空白组增加8.1%，低浓度组多巴胺含量较模型组减少5.5%，中浓度组较模型组减少5.3%，高浓度组较模型组减少5.4%，且三组均与空白组差异不显著，由此可得原花青素会减轻多巴胺增多而导致的机体神经损伤。4.4.3谷胱甘肽含量测定结果将六组斑马鱼解剖后，肝组织按照“3.3.7谷胱甘肽的含量测定”进行含量检测，结果见图16。注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;**与空白组相比，p<0.01，差异显著；***与空白组相比，p<0.001，差异极显著图16不同组谷胱甘肽含量柱状图从图16中可得，DMSO组与空白组差异不显著，可忽略其影响；模型组谷胱甘肽含量较空白组下降34.6%；低浓度组较模型组谷胱甘肽含量上升11.7%，中浓度组较模型组谷胱甘肽含量上升23.1%，高浓度组较模型组谷胱甘肽含量上升49.9%；由此可得葡萄籽原花青素对氧化损伤具有一定的修复作用，高浓度组可使谷胱甘肽含量恢复致正常水平。4.4.4斑马鱼行为学检测结果ImageJ测得斑马鱼行为学结果见图17、18。注：a为空白组，b为模型组，c为DMSO组，d为1mg/L原花青素组，e为1.5mg/L原花青素组，f为3mg/L原花青素组图17各组斑马鱼行为学测定结果（b）注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;**与空白组相比，差异显著；p<0.01，差异显著图18不同组别斑马鱼具体行为学数据由图18（a）（b）与空白组相比，斑马鱼暴露在模型组时静止时间减少，移动距离增加；而低、中、高浓度组以及与空白组相比移动距离与静止时间差异均不显著；结果表明，戊唑醇会导致斑马鱼运动行为增强，给予原花青素则会使其有所恢复。5小结采用响应面法得到葡萄籽胶囊原花青素的最优提取条件为温度49.959℃，乙醇浓度为44.124%，提取时间为104.872min，此条件下原花青素含量为682.6mg/g。低、中、高浓度组斑马鱼肝组织中谷胱甘肽含量均低于空白组，高于模型组，且高浓度组与空白组差异不显著，说明葡萄籽胶囊原花青素对氧化损伤有一定的修复作用，高浓度组会使其恢复到正常水平；斑马鱼脑组织中模型组的多巴胺含量略高于空白组，而低、中、高浓度组均组低于模型组，说明原花青素会减轻多巴胺导致的神经损伤；用ImageJ软件处理后，模型组斑马鱼静止时间低于其他组，移动距离高于其他组，与空白组相比差异较显著，说明戊唑醇使斑马鱼运动行为增强，而低、中、高浓度组与空白组相近，差异不显著，说明给予一定的原花青素对斑马鱼运动行为增强有所恢复。通过优化葡萄籽胶囊原花青素的提取条件，可以探索更高效、经济的提取技术；研究证明了原花青素对斑马鱼氧化损伤的修复作用，对开发原花青素类产品具有重要的价值，为原花青素在动物体内实验上提供实验参考。

参考文献步文磊,王茵.原花青素的生物活性及作用机制研究进展[J].国外医学(卫生学分册),2007:311-315.张慧文,张玉,马超美.原花青素的研究进展[J].食品科学,2015,36:296-304.郑永丽.葡萄籽中原花色素的分析、提取与纯化[J].河北工业大学,2004.刘玟君,李金洲,陈子隽,等.原花青素的研究进展[J].湖北农业科学,2021,60:5-9.杨亚超,宁梦帆,菅蓁.烟台产区酒渣葡萄籽原花青素含量与抗氧化性研究[J].现代食品,2022,28:173-175.李瑞丽,张玎婕,赵琪,等.响应面法优化超声辅助浸提葡萄籽原花青素[J].食品研究与开发,2021,42:53-60.MadiganD,McMurroughI,SmythMR.Determinationofproanthocyanidinsandcatechinsinbeerandbarleybyhigh-performanceliquidchromatographywithdual-electrodeelectrochemicaldetection[J].Analyst,1994,119:863-868.ShojiT,YanagidaA,KandaT.Gelpermeationchromatographyofanthocyaninpigmentsfromroseciderandredwine[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,1999,47:2885-2890.桑雅丽,李晓春,王欣宇,等.山葡萄籽中原花青素的提取及其含量测定[J].赤峰学院学报(自然科学版),2018,34:40-42.顾龙建.基于谷胱甘肽设计的抗氧化肽活性研究[D].广州:华南理工大学,2013.胥鑫萌,王文权,孙洁怡,等.原花青素在化妆品中的应用[J].中国洗涤用品工业,2021:56-60.邱兰丽,颜梓一,贺延苓,等.原花青素抗癌的生物学机制研究进展[J].药物生物技术,2020,27:173-176.吴金滢,胡迪,孙新.原花青素抗衰老作用的研究进展[J].吉林医药学院学报,2022,43:452-454.TerraX,Femandez-LarreaJ,PujadasG,etal.Inhibitoryeffectsofgrapeseedprocyanidinsonfoamcellformationinvitro[J].AgricFoodChem,2009,57:2588－2594．尹梦宇.原花青素定量分析方法及抗氧化功效的应用研究[D].长沙:湖南师范大学,2019.高渊,王雅慧,严啸,等.原花青素对C57BL／6J小鼠动脉舒张功能保护作用的研究[J].热带医学杂志,2013,13:553-556.饶美荣,曾芬,钟咪,等.原花青素抗UVB诱导皮肤成纤维细胞凋亡和氧化损伤的影响[J].中成药,2022,44:4044-4049.步文磊,王茵.原花青素的生物活性及作用机制研究进展[J].国外医学(卫生学分册),2007:311-315.宋玉果,王涤新.谷胱甘肽作为脂质过氧化损伤指标的研究[J].中华预防医学杂志,1999,33:317-319.段理人,李俊英,彭蓉.帕金森病多巴胺失调综合征的研究进展[J].神经疾病与精神卫生,2019,19:6.李凡,舒斯云,包新民.多巴胺受体的结构和功能[J].中国神经科学杂志,2003:405-410.成慧灵,周美,许茜,等.利用七氯对斑马鱼多巴胺神经元毒性影响构建帕金森病模型[J].广西医科大学学报,2022,39:1047-1053.陈晨.典型抗抑郁药物阿米替林对斑马鱼的行为毒性及机制研究[D].南京：江苏大学,2022.HuangT,JiangH,ZhaoY,etal.Acomprehensivereviewof1,2,4-triazolefungicidetoxicity