微生物细胞大小的测定方法及微生物限度检查方法验证方案

微生物细胞大小测定一、实验目的

了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。二、实验原理

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺（图-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表的相对长度。

镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，

图1目镜测微尺图2镜台测微尺

由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。三、实验器材1．活材料：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草杆菌(Baccillussubtilis)染色标本片。2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。四、实验方法1．目镜测微尺的校正

把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。例如目镜测微尺5小方格正好与镜台测微尺5小方格重叠，已知镜台测微尺每小方格为l0μm，则目镜测微尺上每小方格长度为=5×10μm/5＝10μm

用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小方格所代表的长度。

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。2．细胞大小的测定

移去镜台测微尺，换上酵母菌标本片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10—20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。五、实验报告将实验结果填入下列表格表1

目镜测微目尺校正结果物镜

目尺格数

台尺格数

目尺校正值（μm）10×40×100×表2

酵母菌大小测定记录

（格）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

平均值长宽表3枯草杆菌大小测定记录

（格）

细胞数

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

平均值长宽结果计算

长μm＝平均格数×校正值宽μm＝平均格数×校正值大小表示：宽μm×长μm微生物的显微直接计数法一、实验目的

了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。二、实验原理

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。已知：1mm3体积=10mm×10mm×10mm=1000mm3所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。因此：每ml菌悬液中含有细胞数=每个小方格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）三、实验器材1．活材料：酿酒酵母培养液。2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、擦镜纸等。四、实验方法

1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（。2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即100小方格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央l个中方格的菌数（即80个小方格）。如菌体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小方格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。7．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。五、实验报告

将实验结果填入下表中：

计数次数每个大中方格菌数稀释倍数1ml菌液总菌数平均值12345

第一次

第二次

实验室环境和人体表面微生物的检查一、实验目的

1.

证明实验室环境与体表存在微生物。

2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。

3．观察不同类群微生物的菌落形态特征。

4．体会无菌操作的重要性。

二、实验原理

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养1～2d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

三、器材

l．培养基

肉膏蛋白胨琼脂平板。

2．仪器或其他用具

无菌水，灭菌棉签(装在试管内)，接种环，试管架，酒精灯或煤气灯等。

四、操作步骤

l．写标签

任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源(如实验室空气或无菌室空气或头发等)，字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。

2．实验室细菌检查

(1)空气

将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。lh后盖上两个皿盖。(2)实验台和门的旋钮

①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。

②取棉签

左手拿装有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞(或试管帽)，将其取出，将管口很快地通过煤气灯(或酒精灯)的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。塞回棉塞(或试管帽)，并将空试管放在试管梁上。

③弄湿棉签

左手取灭菌水试管，如上法拨出棉塞(或试管帽)并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，塞回棉塞(或试管帽)，并将灭菌水试管放在试管梁上。

④取样

将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围．

⑤接种

在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝．再将棉签伸人，在琼脂表面顶端接种，即滚动一下，立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拨出棉塞(或试管帽)，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。

⑥划线

另取接种环在火焰上灭菌，进行划线，整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。

3．人体细菌的检查

（1）手指(洗手前与洗手后)

①分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后(班级、姓名．日期)。

②移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。

③用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。

(2)头发

在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌降落到玻脂平板表面，然后盖上皿盖。

A.

接种时，用左手将平皿开启一缝；B.棉签伸入平板接种;

C.用己灭菌并冷却了的接种环划线;

D.

第二部分划线;

E.最后部分划线

(3)咳嗽

将去皿盖的琼脂平板放在离口约6～8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。

(4)鼻腔

①按照实验台检查法的步骤②和③，取出棉签，并将其弄湿。

②用湿棉签在鼻腔内滚动数次。

③按实验台检查法的步骤⑤和⑥，接种与划线，然后盖上皿盖。

4．将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃培养箱，培养1～2d。

五．结果记录方法

(1)菌落计数

在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数l/4面积的菌落数。

(2)根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。

菌落特征描写方法如下：

①大小

大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。

②颜色

黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

③干湿情况

干燥、湿润、粘稠。

④形态

圆形、不规则等。

⑤高度

扁平、隆起、凹下。

⑥透明程度

透明、半透明、不透明。

⑦边缘

整齐、不整齐。

六、实验报告1．将实验结果记录于下表中。样品来源菌落数

（近似值）菌落

类型特征描写大小形态干湿高度透明度颜色边缘1.

1

2

3

4

5

2.

1

2

3

4

5

2．与其他同学所做的实验结果进行比较。样品来源菌落数（1/4平板）菌落类型数（近似值）

3．比较各种不同来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？4．人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？5．洗手前后的手指培养基平板，菌落数有无区别？6．通过本次实验，在你防止培养物的污染与防止微生物的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。3.规范性引用文件：

根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ

J

微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。4.验证实施：4.4.1

试验前的准备:

4.4.1.1

试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30

min，在3天内使用。

4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15

min，在3周内使用。

4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15

min，在3周内使用。

4.4.2

试验菌的制备和稀释：

4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：

4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。

4.4.2.1.2将上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释制成每1ml含菌50～100cfu的试验菌液。在黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养基中，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱（菌悬液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌50～100cfu的试验孢子液。

4.4.2.1.3上述菌液在供试验的同时，取1ml注皿、培养、计数；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，于23～28℃倒置培养72小时。

4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液：

4.4.2.2.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，在30～35℃培养18～24小时。

4.4.2.2.2

取上述均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释，制成每1ml含菌10～100cfu的试验菌液。

4.4.2.2.3上述菌液在供试验的同时，取1ml注皿、注入营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培养48小时，计数。

4.4.3供试液的制备：

4.4.3.1

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

4.4.3.2，取供试品养胃舒软胶囊5g，加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20的供试液。

4.4.3.3

供试液的制备如需用水浴加温时，温度不得超过45℃，时间不得超过30min。

5.5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方法:

4.4.4.1

验证试验分4组，照《微生物限度检查法》操作，分别用3个不同批号样品进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照试验组的菌回收率。

4.4.4.2试验组：

4.4.4.2.1

平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。

4.4.4.2.2薄膜过滤法：取1：20的供试液1～10ml，加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥）。用适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量约100ml，总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入一种试验菌液1ml（含菌50～100CFU），滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板。每株试验菌平行制备2个平板。

4.4.4.3菌液组：取试验菌液各1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。

5.5.4.4供试品对照组：

4.4.4.4.1

平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。

4.4.4.4.2薄膜过滤法：取1：20的供试液1～10ml（取用量同试验组），加至100ml稀释液中混匀，按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥）。用冲洗液冲洗滤膜，冲洗液、冲洗量及冲洗次数同试验组，滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于经预培养合格的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基平板上，每种培养基平行制备2个平板。

4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。

4.4.4.5.1平皿法：分别取1ml稀释剂或缓冲液和1ml试验菌液（含菌50～100CFU），注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。

4.4.4.5.2薄膜过滤法：每个滤桶内加入100ml稀释液，按薄膜过滤法过滤，用冲洗液冲洗滤膜，冲洗液、冲洗量及冲洗次数同试验组，在最后一次冲洗液中加入一种试验菌液1ml（含菌50～100CFU），滤过，取出滤膜，菌面朝上贴于相应的经预培养合格的培养基平板上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基平板。每株试验菌平行制备2个平板。

4.4.4.6倾注培养基：在菌液组各平皿中分别倾注15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，其中，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固。

4.4.4.7培养观察：用于细菌计数的营养琼脂培养基平板，倒置于30～35℃的培养箱中，培养48小时；用于霉菌、酵母菌计数的玫瑰红钠琼脂培养基平板，倒置于23～28℃的培养箱中，培养72小时。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。

4.4.4.8菌落计数：将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察并记录结果。4.4.4.9计算回收率

试验组回收率＝试验组平均菌落数稀释剂对照组回收率＝稀释剂对照组的平均菌落数菌液组的平均菌落数

×4.4.4.10结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于70％。试验组的菌回收率均不低于70％，则照该供试液制备方法和计数法测定。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。

4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：

第一次：样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理□保温振摇法

□研钵法

□匀浆仪

档

min

□水溶性供试品：供试品

g(ml)，加稀释剂

ml，制成1：

供试液；取供试液

ml，冲洗次数

次，每膜冲洗量

ml。

□非水溶性供试品：供试品

g(ml)，加乳化剂（名称

；批号

）

g(ml)，加稀释剂

ml，制成1：

供试液；取供试液

ml，冲洗次数

次，每膜冲洗量

ml。

□其它：

。技术方法细菌计数霉菌和酵母菌计数培养基名称营养琼脂培养基

玫瑰红钠琼脂培养基配制批号培养温度培养起止时间菌种名称菌大肠埃希菌金黄色葡萄球枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌种编号菌悬液批号菌液稀释倍数试验组（cfu）12平均菌液组（cfu）12平均稀释剂对照组（cfu）12平均供试品对照组（cfu）12平均试验组回收率(%)稀释剂对照组回收(%)结论检查人/日期复核人/日期第二次：样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理□保温振摇法

□研钵法

□匀浆仪

档

min

□水溶性供试品：供试品

g(ml)，加稀释剂

ml，制成1：

供试液；取供试液

ml，冲洗次数

次，每膜冲洗量

ml。

□非水溶性供试品：供试品

g(ml)，加乳化剂（名称

；批号

）

g(ml)，加稀释剂

ml，制成1：

供试液；取供试液

ml，冲洗次数

次，每膜冲洗量

ml。

□其它：

。技术方法细菌计数霉菌和酵母菌计数培养基名称营养琼脂培养基

玫瑰红钠琼脂培养基配制批号培养温度培养起止时间菌种名称菌大肠埃希菌金黄色葡萄球枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌种编号菌悬液批号菌液稀释倍数试验组（cfu）12平均菌液组（cfu）12平均稀释剂对照组（cfu）12平均供试品对照组（cfu）12平均试验组回收率(%)稀释剂对照组回收(%)结论检查人/日期复核人/日期第三次：样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理□保温振摇法

□研钵法

□匀浆仪

档

min

□水溶性供试品：供试品

g(ml)，加稀释剂

ml，制成1：

供试液；取供试液

ml，冲洗次数

次，每膜冲洗量

ml。

□非水溶性供试品：供试品

g(ml)，加乳化剂（名称

；批号

）

g(ml)，加稀释剂

ml，制成1：

供试液；取供试液

ml，冲洗次数

次，每膜冲洗量

ml。

□其它：

。技术方法细菌计数霉菌和酵母菌计数培养基名称营养琼脂培养基

玫瑰红钠琼脂培养基配制批号培养温度培养起止时间菌种名称菌大肠埃希菌金黄色葡萄球枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌种编号菌悬液批号菌液稀释倍数试验组（cfu）12平均菌液组（cfu）12平均稀释剂对照组（cfu）12平均供试品对照组（cfu）12平均试验组回收率(%)稀释剂对照组回收(%)结论检查人/日期复核人/日期4.4.5控制菌检查方法验证方法:

4.4.5.1

根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌，选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验分3组，分别用3个不同批号样品或同一批号样品进行3次独立的平行试验。

4.4.5.2试验组：

4.4.5.2.1

平皿法：取1：10的供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）和1ml试验菌液（含菌10～100CFU）加入同一增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。

4.4.5.2.2薄膜过滤法：取1：10的供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），按薄膜过滤法过滤（水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜，油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥）。用适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量约100ml，总冲洗量不得超过1000ml，在最后一次冲洗液中加入1ml试验菌液（含菌10～100CFU），滤过，取出滤膜，放入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。

4.4.5.3

阳性对照：取1ml试验菌液（含菌10～100CFU），加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。

4.4.5.4

阴性对照：取10ml稀释剂或缓冲液替代供试液，加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。

4.4.5.5结果判定：在3次独立的平行试验中，阳性对照组应检出试验菌，阴性菌对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，建立新的方法，并重新验证。

4.4.5.6控制菌检查方法验证结果：第一次：控制菌名称样品名称试验日期规格样品批号生产商类别供试液的制备及处理□保温振摇法

□研钵法

□匀浆仪

档

min

□水溶性供试品：供试品

g(ml)，加稀释剂

ml，制成1：

供试液；取供试液

ml，冲洗次数

次，每膜冲洗量

ml。