生物敏感膜的制备

关于生物敏感膜的制备2第一节生物敏感膜

敏感膜的构成：

膜基体

膜材料

生物敏感材料第2页,共76页，2024年2月25日，星期天31、膜基体

膜基体是敏感膜的载体，它关系着有效发挥敏感材料的作用和膜的寿命，也即生物传感器的使用寿命。常用的膜基体有：金属材料，如铂、金、钯等；半导体材料，如石英、玻璃、氮化硅、硅、锗等；有机材料，如聚氯乙烯、硅橡胶、

纤维素等。第3页,共76页，2024年2月25日，星期天42、膜材料

膜材料是固化敏感材料成膜的物质，是敏感材料的支持物。它必须具有一定的刚性和韧性，要适合于敏感材料的搭载与结合；它必须具有化学或物理附着力，以利于固化在膜基体上。第4页,共76页，2024年2月25日，星期天5膜材料包括有四类：⑴有机聚合物类：如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氟乙烯、葡聚糖、硅橡胶等；⑵无机物类:如多孔玻璃、活性炭、石墨、石英、硫化物、粘土等；⑶天然生物材料类：如琼脂、动植物细胞膜、卵磷脂等；⑷人工合成的生物材料类：如各种两亲有机化合物构成的双层脂膜，如磷脂。第5页,共76页，2024年2月25日，星期天63、生物敏感材料

生物敏感材料是生物传感器的核心，有人称它为分子探针。常用的生物敏感材料有：酶、微生物(病毒、细菌)、动植物组织、化学和生物发光物质、抗体和受体、DNA等生物敏感组分。第6页,共76页，2024年2月25日，星期天7具体方式有四种：

⑴膜基体——膜材料——敏感材料

⑵膜基体——膜材料＋敏感材料

⑶膜基体（膜材料）——敏感材料

⑷膜基体＋敏感材料第7页,共76页，2024年2月25日，星期天8第二节生物敏感材料的

固定化技术

生物敏感膜的制备技术就是将生物活性物质进行固定化的技术，它是生物传感器研究的重要内容。

第8页,共76页，2024年2月25日，星期天9

固定化目的：

◆将生物活性物质限制在一定的空间，同时不妨碍底物的自由扩散。

第9页,共76页，2024年2月25日，星期天游离相的生物活性材料固相载体固相生物活性材料（eg：固定化酶）固定化技术第10页,共76页，2024年2月25日，星期天11固定化技术应满足：

◆固化后的生物组分仍能维持良好的生物活性；

◆固定化层要有良好的稳定性和耐用性，且能适应多种测试环境；

第11页,共76页，2024年2月25日，星期天12

生物敏感物质的固定化方法，大致划分为吸附法、包埋法、夹心法、共价键固定法、交联法。第12页,共76页，2024年2月25日，星期天13一、吸附法

吸附法是用非水溶性载体物理吸附或离子结合，使生物组分固定在其表面的方法。

包括：物理吸附

离子交换吸附第13页,共76页，2024年2月25日，星期天14㈠物理吸附法

物理吸附法主要通过范德华力的作用将生物组分吸附在水不溶性的惰性载体上。

常用载体有多孔玻璃、活性炭、氧化铝、石英砂、纤维素膜、葡聚糖、琼脂糖等，

第14页,共76页，2024年2月25日，星期天15优点：

操作简便、条件温和，不会引起生物组分的变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。缺点：对周围环境敏感，结合力弱，生物组分容易脱落。

第15页,共76页，2024年2月25日，星期天16（二）离子交换吸附法

选用具有离子交换的载体，使生物组分与离子交换剂通过离子键结合，形成固定化层。

常用载体有离子交换树脂、二乙胺乙基纤维素、四乙胺乙基纤维素、氨乙基纤维素、羧甲基纤维素等。

制备的固定化酶有葡萄糖淀粉酶、胆固醇氧化酶等。

第16页,共76页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂的结构具有三维空间立体结构的网络骨架联接在骨架上的活性基团活性基团带有可交换的活性离子第17页,共76页，2024年2月25日，星期天二、夹心法

将生物活性材料封闭在双层滤膜之间。

特点：

操作简单，不需要任何化学处理，固定生物量大，响应速度快，重现性好，尤其适用于微生物和组织膜的制作。

第18页,共76页，2024年2月25日，星期天举例微生物膜制备的一般步骤:①将微生物培养离心，洗涤，悬浮；②测定菌体浓度；③取一定量的菌悬液滴到滤膜上；④将水抽干，使菌体成一薄层均匀附着于膜表面；⑤在菌体层上覆盖一层透气膜或微孔滤膜，让微生物夹在两层膜之间。第19页,共76页，2024年2月25日，星期天BOD（生化需氧量）微生物传感器结构示意图第20页,共76页，2024年2月25日，星期天

BOD微生物传感器的电流响应

第21页,共76页，2024年2月25日，星期天22三、包埋法

包埋法是将生物组分包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质中，形成稳定生物组分敏感膜。

第22页,共76页，2024年2月25日，星期天23优点：

◆可采用温和的实验条件及多种凝胶聚合物；

◆对生物组分的活性影响较小；

◆可固定高浓度的生物组分,被包埋物不易渗漏等。第23页,共76页，2024年2月25日，星期天24缺点：

◆分子量大的底物在凝胶网格内扩散较困难，响应速度较慢；

◆若载体是合成凝胶，在聚合物形成过程中对生物组分的活性可能产生影响。第24页,共76页，2024年2月25日，星期天25包埋法包括三种：

聚合物膜包埋法

电聚合物膜包埋法

溶胶-凝胶包埋法

第25页,共76页，2024年2月25日，星期天26㈠聚合物膜包埋法

将生物组分与聚合物单体混合而使生物组分包埋于其中，制备成具有生物活性的敏感膜。

第26页,共76页，2024年2月25日，星期天27㈡电聚合物膜包埋法

将聚合物单体和生物活性物质同时混合于电解液中，通电使单体在电极表面氧化而聚合成膜，同时将生物活性物质包埋于聚合物膜内，直接固定于电极表面，构成生物传感器。

第27页,共76页，2024年2月25日，星期天28优点：●聚合层厚度和酶量容易控制●修饰层重现性好。第28页,共76页，2024年2月25日，星期天29㈢溶胶-凝胶膜包埋法⑴溶胶-凝胶(sol-gel)技术指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经过热处理制得氧化物或其它化合物固体的方法。第29页,共76页，2024年2月25日，星期天30

溶胶（Sol）：是具有液体特征的胶体体系，分散的粒子是固体或者大分子，直径在1-100nm之间。。凝胶（Gel）：是具有固体特征的胶体体系，被分散的物质形成三维网状结构。第30页,共76页，2024年2月25日，星期天31溶胶无固定形状粒子自由运动凝胶固定形状粒子按一定网状结构固定不能自由运动溶胶与凝胶的结构比较第31页,共76页，2024年2月25日，星期天溶胶-凝胶的典型例子：豆浆（sol）豆腐（gel）第32页,共76页，2024年2月25日，星期天33（2）溶胶—凝胶的制备

●金属或半金属醇盐在水、互溶剂（一般为醇）及催化剂（酸或碱）发生水解反应，形成羟基化的产物和相应的醇。

●未羟基化的烷氧基与羟基或两羟基间发生缩合形成胶体状的混合物，即溶胶，水解和缩合过程同时进行；

●最后胶粒间发生聚合、交联，使溶胶黏度逐渐增大，形成凝胶。第33页,共76页，2024年2月25日，星期天34

第34页,共76页，2024年2月25日，星期天35第35页,共76页，2024年2月25日，星期天

硅烷聚合物凝胶的立体构造

第36页,共76页，2024年2月25日，星期天37

图溶胶-凝胶法包埋活性分子的过程

溶胶—凝胶法包埋生物活性分子通常只是物理结合过程。溶胶溶液将活性分子加入溶胶溶液凝胶开始形成活性分子被包埋在凝胶中。

第37页,共76页，2024年2月25日，星期天38（3）溶胶—凝胶法的特点光学透光性强；无电化学降解，具有导电性且易控制；热稳定性好，具有化学惰性；具有一定的刚性；有足够的水，为生物组分提供水溶液的微环境；能均匀地掺入生物组分，实现分子水平上的均匀掺杂。第38页,共76页，2024年2月25日，星期天39四、共价键固定法

将生物组分通过共价键与不溶性载体（转换器探头）结合而固定的方法称共价键固定法，或称载体结合法。

包括3个步骤：

●基底电极表面的活化

●生物分子的偶联

●剩余价键的封闭及除去键合疏松的组分。第39页,共76页，2024年2月25日，星期天载体修饰需满足：

●化学连接稳定●连接长度足够长，减小固相表面的空间位阻●不产生非特异性结合第40页,共76页，2024年2月25日，星期天41

(1)直接化学固定法

将基体表面先经过化学处理或修饰，然后将生物功能物质以共价、离子或配位等方式结合固定于电极表面。第41页,共76页，2024年2月25日，星期天42（2）硅烷化-双功能基团试剂偶联法

采用硅烷化试剂修饰基体表面，使其带上氨基或羟基，然后用双功能偶联剂（如戊二醛）与生物活性分子相结合而使生物组分固定的方法。第42页,共76页，2024年2月25日，星期天43硅烷化—双功能基团试剂偶联法第43页,共76页，2024年2月25日，星期天44⑶自组装（Selfassembling，SA）膜法

基于分子的自组装作用，在固体表面上自然地形成高度有序的单分子层的方法。有些分子通过化学键相互作用能自发吸附在固/液和固/气表面，形成热力学稳定和能量最低的有序膜。

第44页,共76页，2024年2月25日，星期天发生自组装的条件：

动力：提供能量

导向作用：分子在空间的大小和方向上达到分子重新排列的要求，从无序到有序的重新重组。自组装单层膜的形成示意图第45页,共76页，2024年2月25日，星期天46自组装膜的类型：●脂肪酸在金属氧化物表面●有机硅烷在羟基化表面(Si02／Si、A12O3／Al、玻璃等)

●硫醇、二硫化物和硫化物在金属（金、银、铜）表面或半导体表面第46页,共76页，2024年2月25日，星期天47自组装膜的结构：●头基：与基底表面上的反应以共价键或离子键结合。●烷基链：表面活性物质在固体表面有序紧密地排列。

●末端基团：如-CH3，-COOH,-OH,-NH2，-SH。第47页,共76页，2024年2月25日，星期天载体活化的方法48重氮法叠氮法溴化氰法缩合法烷基化法第48页,共76页，2024年2月25日，星期天49(1)重氮法

●芳香族伯胺和亚硝酸作用（在强酸介质下）生成重氮盐的反应称为重氮化。重氮基再与酶分子中的-NH2、-OH、-SH、咪唑基等发生重氮偶联反应，从而制成固定化酶。

第49页,共76页，2024年2月25日，星期天第50页,共76页，2024年2月25日，星期天51●对纤维素等多糖类不溶性载体,可利用于硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)，一端与纤维素上的羟基进行醚化，另一端上的-NH2，经NaNO2与HCl重氮化，重氮基再与酶偶联。

第51页,共76页，2024年2月25日，星期天第52页,共76页，2024年2月25日，星期天53（2）叠氮法

将含羧基的不溶性载体(如羧甲基纤维素、胶原蛋白等)进行甲酯化，再与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物,最后与酶上的-NH2偶联。第53页,共76页，2024年2月25日，星期天第54页,共76页，2024年2月25日，星期天55(3)溴化氢法

将具有-OH的不溶性载体，首先用CNBr活化，形成具有活性的亚胺碳酸衍生物，再与酶上的-NH2偶联。第55页,共76页，2024年2月25日，星期天56第56页,共76页，2024年2月25日，星期天(4)缩合法（肽键法）

酶的-NH2或-COOH与载体的-COOH或-NH2形成肽键，从而制得固定化酶。第57页,共76页，2024年2月25日，星期天58(5)烷基化法

使酶分子中-NH2、-SH、酚基与不溶性载体上的卤素或乙烯磺酰基发生反应，制成固定化酶；也可以使聚酰胺类化合物先经硫酸二甲酯烷基化后，烷氧基再与酶中的-NH2、-SH、酚基等作用，制备固定化酶。

第58页,共76页，2024年2月25日，星期天含羟基的载体可用卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。第59页,共76页，2024年2月25日，星期天60㈢交联共聚法

借助于交联剂(具有两个或两个以上功能基的试剂)的作用，使酶分子间发生共价结合，形成不溶性网状结构的固相酶，也可将酶分子直接与载体共价交联。第60页,共76页，2024年2月25日，星期天61

共价键结合法的特点是结合牢固，蛋白质分子不易脱落，载体不易被生物降解，使用寿命长。缺点是操作步骤比较麻烦，酶活性可能因为发生化学修饰而降低，制备具有高活性的固定化酶比较困难。第61页,共76页，2024年2月25日，星期天62尼龙网酶膜的制备：1）活化尼龙网在硫酸二甲酯中煮沸5分钟；2）洗涤移入无水甲醇3）连接氨基转移到赖氨酸溶液中反应2h，用NaCl清洗；4）加交联剂戊二醛；5）与酶交联。第62页,共76页，2024年2月25日，星期天63五、LB(Langmuir-Blodgett)膜法（一）LB膜

把液面上有序排列的有机化合物逐层地转移到固定基片上，在分子水平上制造出按有序排列的分子组合体，成为单分子层或几个多分子层的修饰薄膜。

第63页,共76页，2024年2月25日，星期天64（二）LB膜的特点1.膜厚度可精确控制，可精确到纳米级；2.膜内分子排列有序而致密，均一性好；3.脂质双层膜同生物膜结果相似，是理想的仿生膜，具有极佳的生物相容性；4.可把活性物质固定在LB膜的预定位置，制成具有特殊功能的生物传感器。第64页,共76页，2024年2月25日，星期天制备LB膜的装置示意图

（三）LB膜的制备过程及制备方式第65页,共76页，2024年2月25日，星期天制膜过程示意图第66页,共76页，2024年2月25日，星期天67按照转移（挂膜）式电极表面相对于水面的相对运动方向，可将LB膜的制备分为X,Y和Z三种方式。第67页,共76页，2024年2月25日，星期天68X法：将电极表面垂直