疏水层析相互作用

关于疏水层析相互作用一、疏水层析的概念及原理

“疏水作用”一词是Kauzmann于1959年首次在“蛋白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者发表用疏水层析成功分离蛋白质的文献报道；如钙调蛋白、苯丙氨酸裂解酶、凝集素等。（一）疏水层析的来历及概念

1972年，ErelZ.等人将不同链长的α，ω—二胺同系物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子的重要作用。

疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品；

目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。第2页,共41页，2024年2月25日，星期天

（二）原理

疏水层析是利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分离开。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。第3页,共41页，2024年2月25日，星期天

高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合基质疏水配基疏水补丁第4页,共41页，2024年2月25日，星期天疏水相互作用的机制A.高离子强度环境下（高盐浓度），疏水性样品分子结合在填料上。B.随着盐浓度降低，结合的样品分子按照疏水性强弱洗脱下来第5页,共41页，2024年2月25日，星期天二、疏水层析过程

介质的选择样品的准备层析条件的优化

第6页,共41页，2024年2月25日，星期天（一）、介质（基质+配基）的选择

基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。近年来研制超大(superporous)琼脂糖，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率。壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用第7页,共41页，2024年2月25日，星期天

HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与反相层析介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。

R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度第8页,共41页，2024年2月25日，星期天偶联至基质的常见配基类型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基

第9页,共41页，2024年2月25日，星期天

对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，为洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。第10页,共41页，2024年2月25日，星期天常用的疏水层析介质⒈OctylSepharose4FastFlow(辛基琼脂糖凝胶4FF)

工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,载量为每ml填料结合50μmol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。⒉ButylSepharose4FastFlow(丁基琼脂糖凝胶4FF)工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h,载量为每ml填料结合50umol正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。第11页,共41页，2024年2月25日，星期天⒊PhenylSepharose6FastFlow(苯基琼脂糖凝胶4FF)

疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，载量为每ml填料结合40umol苯基，工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h。⒋PhenylSepharoseCL-4B(苯基琼脂糖凝胶CL-4B)

疏水性较Octyl弱，适用于分离和纯化对疏水性尚未了解的蛋白，载量为每ml填料结合40umol苯基；工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是50cm/h。第12页,共41页，2024年2月25日，星期天在HIC中，应选机械强度较大的刚性基质；若待分离物质分子量很大，且样品量较大，则应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待分离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质。HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生π-π相互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基与苯基之间。第13页,共41页，2024年2月25日，星期天不同的介质对同一样品有不同的分离效果：第14页,共41页，2024年2月25日，星期天填料的筛选试验

试管法筛选填料1.取6支试管，标号1，2，3，4，5，6；2.取不同的填料，分装于6支离心管中；3.向装了填料的试管中加入样品；4.混匀，离心，分别检测6支试管上清的样品活性；5.选择目的蛋白结合效果最好的填料。123456管号各种填料的试管分别向各试管中加入样品第15页,共41页，2024年2月25日，星期天预装柱筛选法试验流程：1.平衡缓冲液：50mM磷酸盐、PH7.0，再加入硫酸铵。2.洗脱缓冲液：50mM磷酸盐、PH7.0。3.样品准备:往样品中添加适量浓度的硫酸铵，使样品溶液中的盐浓度与平衡缓冲液中基本一致，并调节样品溶液的pH。（后将介绍样品准备的硫酸铵沉淀法）4.用1ml/min的流速，5-10个CV的平衡缓冲液平衡柱子。5.用1ml/min的流速上样，上样过程中收集穿透液。选取不同填料的1ml的预装柱进行试验第16页,共41页，2024年2月25日，星期天6.上完样后以1ml/min的流速，继续用平衡缓冲液冲洗直到紫外、电导基线平稳（至少5个CV），过程中收集洗脱物。7.用洗脱缓冲液以1ml/min的流速进行洗脱，洗3-5个CV，收集洗脱峰。8.检测每一个预装柱洗脱下来的洗脱峰的纯度及含量。

选择目的蛋白能够结合并且洗脱下来效果最好的填料，如果进行梯度洗脱，选择选择性和分辨率最好的填料第17页,共41页，2024年2月25日，星期天基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。（二）、样品准备（即样品处理）----实例试剂耗材及设备硫酸铵沉淀法-----抗体的纯化1.血清；2.硫酸铵饱和溶液:硫酸铵800g~850g加水1000ml，加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0；3.0.01mol/LpH7.4PBS溶液；用0.10mol/LNaH2PO4溶液和0.10mol/LNa2HPO4溶液按一定比例混合；4.透析袋；5.高速冷冻离心机；6.PH计。第18页,共41页，2024年2月25日，星期天实验过程1.取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成20%（NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。2.40C、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。3.在上清液中再加（NH4)2SO4饱和溶液30ml，使成为50%（NH4)2SO4溶液，充分混合，静置30min。4.40C、3000r/min离心20min，弃上清。5.于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成为33%（NH4)2SO4溶液，充分混合后，静置30min。6.40C、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。7.用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。8.透析除盐，在纯水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。9.透析液中的盐可以使用脱盐柱SephadexTMG-25除去。第19页,共41页，2024年2月25日，星期天（三）、层析条件的优化缓冲体系和PH的选择离子强度的选择其他盐的选择洗脱方式的选择第20页,共41页，2024年2月25日，星期天

疏水层析缓冲液中的pH对整个分离的影响不大，一般调至中性（6－8）左右.溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境，而且蛋白质结合疏水填料的能力一般在pH6-8下没有什么变化。当溶液的pH接近蛋白质的等电点时，其疏水性增加，有利于与配基结合。（若缓冲液的PH为蛋白的PI，则蛋白易发生沉淀）1.缓冲体系和PH的选择：PH的选择第21页,共41页，2024年2月25日，星期天缓冲体系的选择试管法筛选缓冲体系向各试管中加入不同的缓冲体系管号12341.取4支试管，标号1，2，3，4；2.配置不同的缓冲体系如Tris-Hcl、PBS、NaAc-HAc、柠檬酸-柠檬酸钠等；3.向4支试管中加入2中配制的不同缓冲体系；4.混匀，静置2h后检测4支试管中样品活性及稳定性；5.选择活性及稳定性最好的缓冲体系。实验过程

未知样品建议使用的缓冲液：起始缓冲液：1.5M硫酸铵，50mM

PBS，PH7.0洗脱缓冲液：50mM

PBS，PH7.0第22页,共41页，2024年2月25日，星期天如同填料选择一样，疏水相互作用层析中盐的选择也是不断尝试的过程，因为每种盐在促进疏水相互作用方面的能力都不同，随着盐浓度的增加，结合的蛋白几乎随着线性增加，直到一个特殊的盐浓度，然后随着盐浓度的增加，结合的蛋白呈指数形式增加

在实践中，钠、钾或铵的硫酸盐具有有效的促进了疏水相互作用层析中配基和蛋白的相互作用，并且对蛋白结构具有稳定作用。因此，最通常使用的盐是硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化钾和醋酸铵。2.盐的选择

建议：1.在给定的浓度下，和其他盐相比，硫酸铵能够给出最好的分辨率，可以使用的最高浓度是2M。2.3M的盐浓度通常需要使用氯化钠3.硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在高浓度下，蛋白不是稳定定。4.硫酸铵不推荐在PH8.0下使用第23页,共41页，2024年2月25日，星期天下图显示的是不同的盐如何影响选择性的.按出峰顺序依次为：细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A，ａ-糜蛋白酶原第24页,共41页，2024年2月25日，星期天3.离子强度的选择在所使用的盐的种类确定的前提下，盐浓度的高低会影响溶质分子与介质的结合强度及介质的结合容量。蛋白质的疏水性吸附作用随缓冲液的离子强度提高而增加，因此HIC通常在略低于盐析点的盐浓度上样吸附，而洗脱时逐渐降低洗脱液的离子强度。下图为不同离子强度对蛋白分离的选择性的影响：在这个例子中，目的蛋白是最后一个洗脱峰。在（a）中，目的蛋白在较窄的区域洗脱，容易造成杂质和目的蛋白一起被洗脱下来；在（b）中，此时在上一次使用较高盐浓度运行过程中结合的杂蛋白现在在初始的洗脱阶段洗脱，剩下目的蛋白结合着，降低了杂质和目的蛋白一起洗脱下来的风险，并且增加了柱子对目的蛋白的载量；（c）图,由于初始盐浓度较低，样品在上样的过程中结合的不够紧，导致在洗脱过程中洗脱峰显著的展宽。第25页,共41页，2024年2月25日，星期天离子强度确定方法试管法123456管号↓↓↓↓↓↓2.0M1.5M1.0M0.5M0.1M0.05M盐以硫酸铵为例加入各浓度的硫酸铵实验过程：1.取六支试管，标号为1，2，3，4，5，6；2.向6支试管中加入含不同浓度硫酸铵的平衡缓冲液；3.向各试管中加入样品；4.混匀，静置30-60min；5.取上清，检测上清液中蛋白含量及纯度；6.选择目的蛋白刚好完全结合而杂质不结合或结合很少的盐浓度。第26页,共41页，2024年2月25日，星期天预装柱法实验过程：1.配置含有不同浓度硫酸铵（0.05M-2M）的平衡缓冲液；2.1ml/min的流速，用5-10个CV的平衡缓冲液（含2M的硫酸铵）平衡柱子；3.用1ml/min的流速上样，收集穿透液；4.1ml/min的流速，至少用5个CV的起始缓冲液（含2.0M的硫酸铵）继续平衡柱子直到紫外、电导基线平稳；5.1ml/min的流速，用3-5个CV的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰；6.重复2-5步骤，每次将上述步骤2中的平衡缓冲液改为含1.5M硫酸铵的平衡缓冲液。直到使用含有0.05M硫酸铵的起始缓冲液；7.分析所有的洗脱峰，检测纯度和结合到柱子上的量；8.确定能够让目的蛋白结合而杂蛋白流出的盐浓度。确定需要使目的蛋白完全洗脱下来的最低的盐浓度。使用1ml的预装柱第27页,共41页，2024年2月25日，星期天4.洗脱方式的选择

结合的蛋白可以通过控制降低盐浓度来洗脱。根据分离的目的可以选择线性梯度洗脱或者逐步洗脱。（1）线性梯度洗脱：1.高分辨率的分离或分析；2.确定逐步洗脱的条件；3.在保持需要的分辨率条件下可用增加流速来优化梯度洗脱。

线性梯度洗脱是最常用的洗脱方式：当从一个未知的样品开始时，通常使用线性梯度洗脱，尽可能的让各种组分结合在填料上，然后分别洗脱下来看总的蛋白图样。随着缓冲液中盐浓度的降低，疏水相互作用也会逐渐减弱，结合的物质开始被洗脱。特点

用10-30个柱体积进行梯度洗脱，增加洗脱缓冲液的比例，直到盐浓度达到最低即无盐缓冲液。第28页,共41页，2024年2月25日，星期天（2）逐步洗脱：洗脱步骤：第一步，洗脱缓冲液的盐浓度和体积经过优化来洗脱所有和柱子结合能力比目的蛋白弱的的物质，注意，盐浓度和缓冲液体积应该足够大，以用来洗脱结合弱的杂质，但是一定不能低于目的蛋白开始共同洗脱出峰的水平。（例如目的蛋白被洗脱出峰的盐浓度为1.2M,则洗脱缓冲液的盐浓度应高于1.2M）第二步，盐浓度降低到目的蛋白洗脱的水平。注意，盐浓度应该足够低来洗脱目的蛋白而不过分稀释，但是浓度又必须保持高于一定水平以防止结合的杂质被共同洗脱。第三步，盐浓度进一步降低来洗脱残余的杂质，这一步可以直接用无盐缓冲液。第四步，柱子用起始缓冲液平衡，为下一步做准备。

最多用5个柱体积的洗脱缓冲液（盐浓度低于起始缓冲液的浓度）洗脱结合蛋白，重复，降低每一步的盐浓度，直到目的蛋白被洗脱下来。

当疏水层析作用已经用线性梯度洗脱优化过了，转换到逐步洗脱可以降低分离所用的总柱体积数，有助于加快分离时间，减少缓冲液消耗，而且保持需要的纯度，这种类型的逐步洗脱通常用于常规的、大规模的分离。

特点第29页,共41页，2024年2月25日，星期天5.其他

一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。

如下图说明了样品、起始和洗脱缓冲液、柱子、层析设备在相同温度的重要性。两次分离都在室温（23度），相同的条件下（除了样品温度在23或4度)进行。所有的组分都在同一温度时，目的蛋白结合了，然后在梯度的中间被洗脱，而样品的温度在4度时，目的蛋白在穿透中洗脱。（1）.柱温第30页,共41页，2024年2月25日，星期天根据分离阶段的不同，流速也不一样。如在平衡、洗涤、再平衡的过程中可以稍微提高流速；在上样和线性洗脱或时建议使用低流速，以免流穿或分离不开。（2）.流速（3）.上样量第31页,共41页，2024年2月25日，星期天三、应用蛋白类（包括酶）、肽类的分离

钙调蛋白的纯化疏水作用层析法纯化抗乙肝病毒核心抗原单克隆抗体第32页,共41页，2024年2月25日，星期天牛皮层骨中纯化酸性磷酸酶：ABCD（A）CM-Sepharose阳离子交换层析，（B）磷酸纤维素亲和层析，（C）SephacrylS-200凝胶过滤层析，（D）Phenyl-Sepharose疏水作用层析

第33页,共41页，2024年2月25日，星期天钙调蛋白纯化过程1.除去填料中的乙醇后，以50%（m/v）浓度悬于10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，

2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巯基乙醇（E液）---50mmol/LNacl,1mmol/L尿素的溶液中;2.层析柱（2.5cm*10cm，装40ml填料）：用3-5个CV的10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巯基乙醇（F液），进行平衡；3.将离子交换层析分离好的钙调蛋白，用F液透析后，补加固体CaCl2于样品（终浓度为1mmol/L,，确保钙离子处于饱和状态，并有效的与固定相结合），接着上样；4.用2-4CV的含0.2mol/LNaCl的F液进行洗脱，以除去吸附力弱的杂质及与钙调蛋白结合的一些蛋白；5.用含0.2mol/LNaCl的E液进行洗脱，使有效成分解离（EDTA对Ca2+有较大的亲和力，Mg2+可置换柱中Ca2+）；6.即可得到较为纯的鸡胗钙调蛋白。

钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域可以结合一个Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当稳定。苯基-SepharoseCL-4B第34页,共41页，2024年2月25日，星期天疏水作用层析法纯化抗乙肝病毒核心抗原单克隆抗体目的:采用疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原(HBcAg)单克隆抗体(mAb),并对分离条件进行优化。方法:

采用不同疏水层析介质、溶液pH和NaCl浓度,研究其对抗体吸附的影响,以及分析不同的洗脱方式和洗脱体积对抗体洗脱的影响,并用ELISA法检测纯化后抗体的活性。结果:疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗HB2cAgmAb(IgG1)的最适条件是以pH7.0、20mmol/LPB+1.2mol/L(NH4)2SO4为上样缓冲液,采用1.2～0mol/L(NH4)2SO4,12CV梯度进行洗脱,获得的mAb纯度大于75%,回收率达80%,纯化后mAb的活性保持良好。结论:采用疏水作用层析对mAb进行纯化,并优化了各步实验条件,为建立具有抗体纯度高、生物学活性好、易于放大的抗HBcAg的mAb的纯化方法提供了必要的实验基础第35页,共41页，2024年2月25日，星期天

近年来，随着层析技术的发展，与HIC相关的其它层析技术也得到了发展，主要有以下两种：

1）亲硫性疏水层析(thio—philicchromatography)

2）疏水电荷诱导层析(HCIC)

四、发展趋势第36页,共41页，2024