植物器官的培养

关于植物器官的培养2024/4/152一、器官培养的种类包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。以器官作为外植体进行离体培养，是植物组织培养中最主要的一个方面，进行的植物种类最多，应用的范围也最广。第一节概述第2页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/153

二、器官培养的意义：

1.器官培养是研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成的最好材料和方法；2.器官培养在生产实践上具有重要的应用价值.

第3页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/154

如利用茎、叶和花器培养建立的试管苗，可在短期内提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；利用茎尖培养可得到脱毒试管苗，解决品种的退化问题，提高产量和质量；将植物器官作诱变处理，用器官培养可得到突变株，进行细胞突变育种。第4页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/155植物器官培养营养器官培养生殖器官培养根培养茎培养（包括茎尖、茎段）叶培养（包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶）花培养（包括花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药）种子培养（包括成熟与未成熟）胚胎培养（包括幼胚、成熟胚、胚珠、子房、胚乳培养）第5页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/156第二节营养器官的培养一、离体根的培养二、茎尖的培养三、茎段的培养四、离体叶的培养第6页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/157一、离体根的培养

（一）意义：①生理代谢研究的优良实验体系②研究器官分化形态建成的良好体系③建立快速生长的根无性系④进行诱变育种第7页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1581.培养基选择

White培养基；2/3或1/2MS和B5培养基注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养温度25－27℃，暗光培养。（二）培养方法第8页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1592.无性繁殖系的建立

种子消毒→→接种→→待根伸长后从根尖一端切取长1.2cm的根尖→→接种于培养基→→发育出侧根→→待侧根生长约1周后切取侧根的根尖进行扩大培养→→又迅速生长并长出侧根→→切下进行培养，如此反复→→得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。

3.培养条件

暗光和温度25-27℃。第9页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1510根无性繁殖系的建立根无性繁殖系无菌种子

1.2cm接后1周侧根反复转接第10页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1511

4.植株再生培养

根段的离体培养也可以用来再生植株。第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、在愈伤组织上分化成小植株。

离体根愈伤组织分化芽再生植株再分化培养基脱分化培养基第11页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1512二、茎尖的培养（一）茎尖培养概念及类型（二）茎尖培养方法及步骤第12页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1513

(一)茎尖培养概念及类型

1.茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为：

2.微茎尖培养:带有1-2个叶原基的生长锥,其长度不超过0.5mm。

第13页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15143.普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽。这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短。4.茎尖培养的意义：普通茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗时间短，加快繁殖。微茎尖培养可获得脱毒苗；第14页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1515（二）茎尖培养方法及步骤取材材料处理及消毒培养接种驯化移栽第15页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1516①直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（1－2cm）（取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。②从试管苗获取。1、取材取1-2㎝顶梢第16页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15172、材料处理及消毒

将采集到的茎尖切成0.5-1.0cm长→→去叶（休眠芽预先剥除鳞片）→→流水冲洗2-4h→→75％的酒精中处理30s→→稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min(取自老枝条上的可适当延长时间）

→→用无菌水冲洗数次，准备接种。

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3、接种

接种前再剥掉一些叶片，使茎尖0.5cm→→接种要求：随切随接，动作迅速。亦可将切下茎尖材料在1－5%VC液中浸一下。第18页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15194、培养的方法和程序（1）培养基①基本培养基MS、White、B5、

Heller培养基。

②蔗糖作碳源效果好，浓度2－3%。③激素（2，4-D，IAA，NAA）和有机添加物有明显影响。但激素浓度以0.1mg/L为宜，不要太高。第19页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1520生长太慢：茎尖不增大→→变绿→→细胞逐渐老化→→休眠原因:生长素浓度太低；温度过低或过高；生长太快：茎尖迅速增大→→愈伤组织→→丧失成苗能力原因:生长素浓度过高；光照太弱或温度太高；生长正常：茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。茎尖生长状态第20页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1521（2）初代培养条件

每天光照16h，光强度1500-30001x，

温度25±2℃

第21页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1522（3）继代培养

茎尖长成的新梢→→切成小段→→增殖培养基中→→1个月左右→→新梢又可切成小段→→再转入新培养基→→建立和维持了茎尖无性系。（即微型扦插）

继代培养可用MS培养基。第22页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1523

（4）诱导生根

采用1／2MS培养基

加入一定的生长素类调节物质，如NAA、IBA等。新梢基部浸入50或100mg/l的IBA溶液处理4-8h，然后转移到无激素的生根培养基中。第23页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1524(5)驯化移栽入土

在生根培养1个月左右→→生长健壮而发达的根系→→炼苗→→移栽→→管理（温、光、湿、气）第24页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1525

（一）定义：指不带芽和带一个以上定芽或不定芽（包括块茎、球茎在内）的幼茎切段的无菌培养。

三、茎段培养第25页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1526（二）意义：

快速繁殖；探讨茎细胞的生理特点进行育种上的筛选突变体的过程第26页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1527（三）培养步骤1.材料的选择和处理

（1）取材：当年生嫩枝→→去叶→→剪成5cm的小段→→自来水冲洗1-3h

注：生长期取芽，外植体取枝条顶部或中部茎段。第27页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1528（2）消毒与接种：

将材料切割成2-3cm长短→→无菌条件下用75％酒精灭菌30-60s

→无菌水冲洗→→0.1％升汞浸泡3-8min（饱和漂白粉浸泡10-20min）→→无菌水冲洗数次→切割成0.5cm→以备接种。第28页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15292.培养

(1)培养基的选择：MS+3％蔗糖+0.7％琼脂+激素（促进腋芽增殖6-BA﹥Kt和Ze）(2)培养条件：保持25℃左右，给予充分的光照和光期第29页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1530(3)继代培养：

途径一：促进腋芽的快速生长优点：不会产生变异，方法简便，每年从一个芽可增殖10万株以上途径二：诱导形成大量不定芽。优点：产生变异。继代增殖过程注意选用培养基和生长调节剂第30页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1531（4）生根培养

目的：使再生的大量试管苗形成根系，获得完整的植株。培养基选择：1/2，1/3或1/4的MS，B5培养基或White培养基附加生长素（浓度NAA0.1-1.0mg/L，IBA和IAA可稍高）而降低或除去细胞分裂素。最好添加0.3％活性炭，以促进生根

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3.移植

移植是一个由异养转变为自养的过程。试管苗→→炼苗→→取苗→→洗净琼脂→→小心移栽→→苗期管理（初期湿度要大，基质通气湿润，保湿保温）第32页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1533

（一）定义：

离体叶培养指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出茎和根。其中叶片培养是一个典型的代表。

四、离体叶的培养第33页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1534（二）意义：

1.是繁殖稀有名贵品种的有效手段；

2.可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题。第34页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1535（三）叶片的离体培养方法

发育方式：叶片培养再生成完整植株有两种方式：①是直接诱导形成芽和根→→完整植株；

②是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化形成芽和根→→完整植株。其中，以第二种方式最为常见。第35页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1536叶片离体培养发育方式（成苗途径）叶原基叶鞘叶片子叶叶柄愈伤组织茎和根试管苗

不定芽第36页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1537

1.材料选择及灭菌

取植物的幼嫩叶片，切割成适当大小（2—3cm），在流水中冲洗干净。再用70％酒精浸泡约10s→→饱和漂白粉液中浸3-15min，或在0.1％升汞中浸3-5min→→无菌水冲洗数次→→无菌的干滤纸上吸干水分→→接种。注：细嫩与成熟叶片消毒时间不同第37页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15382.接种

外植体大小：0.5cm2薄片（叶柄、子叶）上表皮朝上接种培养基。最好带叶脉，注意极性第38页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15393.培养

（1）培养基：

MS、B5、White、N6；蔗糖3%；2.4－D利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形成，利于根发生，KT、6-BA利于芽形成。愈伤组织诱导：BA1-3mg/L,NAA0.25-1mg/L；

分化培养：CTK2mg/L；

生根培养：NAA0.5－1.0mg/L第39页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1540(2)培养过程：

培养约2周至4周→→形成愈伤组织→→再分化培养基上（附加6-BA2mg／L）进行分化培养→→约10d左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点→→发育成无根苗→→生根培养基（附加NAA0.5-lmg/L）→→发育形成完整植株。第40页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1541(3)培养条件：

温度：25±2℃

光照时间：10-12h，光照强度：1500-3000Lx。第41页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1542

叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。第42页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1543第二节生殖器官的培养一、花器官的培养二、种子的培养三、胚胎的培养四、胚珠培养五、子房培养六、胚乳培养第43页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1544一、花器官的培养第44页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15451.定义：花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。

一、花器官的培养（花蕾）第45页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15462、意义：

通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用生产上也可用于珍贵品种的扩大繁殖。第46页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1547

3.培养方法

(1)取材、消毒

从健壮植株上取未开放的花蕾→75％酒精浸润约30s→饱和漂白粉浸泡10-15min（或0.1％升汞中浸3-5min）→无菌水冲洗数次→接种。

第47页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1548(2)接种花蕾培养：花梗插入培养基中。部分花器培养：切片接入培养基中(3)培养培养基：MS、B5。附加生长素（NAA0.1mg/L）和细胞分裂素（6-BA2mg/L），诱导形成愈伤组织或胚状体，再分化培养成植株第48页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1549培养条件：温度：25±2℃

光照时间：10-12h，光照强度：1500-3000Lx培养约1周，形成少量愈伤组织。再经1个月就分化出绿色芽点，再切割转接，可形成大量无根苗，经长根成植株，用于繁殖。第49页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1550二、种子培养第50页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1551定义：

种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。第51页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15522.意义：可以打破种子休眠，促进萌发；解决远缘杂种败育性，产生后代；快速繁殖苗木优点：植株分化容易，无菌操作方便第52页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1553

3.培养技术

(1)种子灭菌

种皮厚或不饱满的种子，宜用0.1％升汞消毒10-20min。幼嫩的或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒15-30min。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95％酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。第53页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1554(2)培养基：A.促种子萌发用MS培养基，加或不加激素，诱导愈伤组织则可加入6-BA或2,4-D。B.无胚乳种子应适当加生长素。C.一般糖浓度为1-3%。D.打破休眠可加GA，或在接种前浸种处理。第54页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1555(3)接种培养

把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中，均匀排列

培养条件：温度20-28℃光强1000-20001x，每天光照10-12h第55页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1556植物胚胎培养是胚及胚器官(如子房、胚珠)在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。三、胚胎的培养第56页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1557胚胎培养已有近百年的历史：1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗。30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展第57页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1558（一）胚胎培养的意义克服远缘杂种的不育性；使胚发育不全的植物获得后代缩短育种年限；研究与胚发育有关的内外因素第58页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1559（二）离体胚培养

离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养。第59页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/15601.成熟胚培养

指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有大量无机元素和糖的基本培养基上，就能正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子用70％酒精进行几秒钟的表面消毒→无菌水冲洗3-4次→无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。第60页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1561

培养基：WhiteTukeyMS无机盐+糖(1-2%)+生长辅助物质(激素、AA、活性炭、维生素等)第61页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1562幼胚是指子叶期以前的幼小胚。由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，其研究应用越来越深入广泛。幼胚培养技术：心形期胚或更早期的胚（长度仅0.1～0.2mm）胚越小就越难培养,幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等

2.幼胚（未成熟胚）培养：第62页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1563（1）未成熟胚胎的培养有三种不同的发育方式：a.继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；b.早熟萌发，即培养后迅速萌发成幼苗；c.胚在培养基中发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。

第63页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1564（2）幼胚培养技术幼胚培养的操作方法与成熟胚培养方法基本相同。值得注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要细心，尽量取出完整的胚。幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。第64页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1565

①培养基幼胚对培养基要求较高，常用的培养基有Tukey，Nitch、MS，B5培养基；通常存在的影响条件如下：第65页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1566②生长调节物质

不同植物的胚培养需要的生长物质不同。如IAA可明显促进向日葵胚的生长；IAA，Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长；一般认为IAA可使胚的长度增加；加入BA可提高胚的生存机会；第66页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1567③天然提取物的作用

椰乳对胚培养有一定的促进作用（番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长）一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力。第67页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1568④温光条件

对于大多数植物的胚来说，在25-30℃为宜早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20℃为好。光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。第68页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1569⑤其它条件

胚培养中除要求较高的蔗糖（4.5%）浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。第69页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1570四、胚珠培养（一）定义：胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。第70页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1571柱头花柱子房花梗花托花组成第71页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1572胚囊卵细胞株心珠孔反足细胞珠被胚珠极核

株柄第72页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1573（二）意义：

胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。

第73页,共81页，2024年2月25日，星期天2024/4/1574（三）培养技术：

从花中取出子房→→70%酒精消毒30