跨膜区突变对ABC转运蛋白Pdr5p功能的影响及其机制研究的开题报告_第1页
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跨膜区突变对ABC转运蛋白Pdr5p功能的影响及其机制研究的开题报告研究现状及背景ABC转运蛋白（ATP-bindingcassettetransporter）是一类供能型跨膜蛋白，在生物物种中广泛存在，包括微生物、植物和动物。ABC转运蛋白主要作用是将化合物从细胞内向细胞外（或外向转运）或从细胞外向细胞内（或内向转运）转运，从而调节细胞内外物质平衡和代谢。ABC转运蛋白由两个跨膜区和两个结构域分子构成，其中结构域分子含有ATP结合位点，ATP水解可以为转运蛋白提供能量。在许多微生物中，ABC转运蛋白Pdr5p是一种减少细胞药物耐受性的关键蛋白。Pdr5p能够外向转运各种类药物，包括抗真菌药乙酰螺旋霉素、未适应抗生素对革兰氏阳性菌和碱性耐药性对环磷酰胺等。Pdr5p的点突变、碱基插入、缺失和增强表达等都会导致药物耐受性的增强。因此，研究Pdr5p的功能和调节机制对于开发新型的抗菌药物具有重要意义。近年来，有研究表明Pdr5p的跨膜区的突变对其功能产生了影响，但是其详细的分子机制尚不清楚。因此，本课题将研究Pdr5p跨膜区突变对其功能和结构的影响，发掘其机制，为进一步揭示ABC转运蛋白的功能与调节提供理论依据。研究目的1.研究Pdr5p跨膜区突变对其功能的影响。2.探究Pdr5p跨膜区突变对其结构的影响。3.发掘Pdr5p跨膜区突变对蛋白功能影响的分子机制。研究内容1.构建Pdr5pGFP融合蛋白。2.构建Pdr5p跨膜区突变体。3.对Pdr5p和突变体进行细胞小生境下的功能分析，比较药物敏感性。4.进行表达纯化蛋白，进行X射线晶体学测定结构。研究方法1.PCR扩增目的基因，构建重组表达质粒。2.制备适量质粒，用吸入法转化毕赤酵母。3.构建突变体，使用PCR引物扩增突变部分，与基因克隆受体连接，利用OE-PCR法进行端部重组。4.筛选突变质粒，进行转化和繁殖。5.观察毕赤酵母在药物小生境下的生长情况，比较抗性差异。6.利用重组和洗脱法制备Pdr5p和突变体的表达蛋白样品，进行X射线晶体学测定结构。7.对产生的晶体进行X射线晶体学数据处理和结构分析。可行性分析毕赤酵母可以外表达和定位ABC转运蛋白，且Pdr5p在毕赤酵母中外表达后可以转运多种药物。已有研究表明，Pdr5p跨膜区的氨基酸是ABC转运蛋白转运药物的关键结构部位之一，该突变部位越多，药物抗性就越强。因此，我们的研究方向和目的是可行的。同时，晶体学方法是揭示跨膜跨膜蛋白三维结构的一种重要方法，也有许多成功的应用案例，因此也具有一定的可行性。预期结果及意义借助于功能分析和结构分析，对比了Pdr5p和其突变体的药物抗性和结构变化。结果表明突变部分与乙酰螺

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