植物器官培养

关于植物器官培养器官培养(Organculture)植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养。根段、根尖、茎段、茎尖、块茎、球茎、叶片、子叶、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。第2页,共40页，2024年2月25日，星期天外植体选择：p28洗涤：p19灭菌：器皿灭菌p20，外植体消毒p29第一节植物器官及组织培养的一般程序培养基的选择：基本培养基＋生长调节剂p21培养基配置：特别是植物生长调节剂配置、保存p26-27培养基灭菌：（尤其是某些不能高温高压灭菌的物质）p20无菌操作（技术）p21Success!植物（活体）培养基（载体）第3页,共40页，2024年2月25日，星期天一般程序(p29-30)外植体取材自来水冲洗10min以上表面消毒10-30s

选择适合消毒剂处理无菌水冲洗3-5次放入无菌培养皿备用(剪成小段置于烧杯)70％酒精数分钟(p29)外植体消毒第4页,共40页，2024年2月25日，星期天植物组织培养形态发生和植株再生外植体(Explant)DedifferentiationRedifferentiation体细胞胚胎发生途径2(Somaticembryogenesis)器官发生途径1(Organegenesis)Plant愈伤组织(Callus)第5页,共40页，2024年2月25日，星期天一、概念和意义1.茎尖培养概念茎尖分生组织培养指对不超过0.1mm的茎尖或几十微米的茎尖进行的培养。特点：可获脱病毒苗，操作困难，成苗时间长。

普通茎尖培养对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。操作技术简单、易成活、成苗时间短、繁殖速度快。

第二节茎尖培养第6页,共40页，2024年2月25日，星期天茎段

茎尖取材有限，可采用带芽或不带芽的茎段进行培养。优点容易成功、变异小、性状一致、繁殖速度快。用于快速繁殖。第7页,共40页，2024年2月25日，星期天茎尖培养在园艺植物离体培养中最常见，可快速繁殖无性系；培养脱病毒苗、品种改良；基础研究。2.茎尖培养意义蜡梅——茎段第8页,共40页，2024年2月25日，星期天（一）建立无菌材料健壮枝梢去除叶片分成1-2cm自来水冲洗消毒75%的酒精30秒0.1%升汞或2%次氯酸钠消毒8-10min无菌水修剪剥离茎尖，通常切割下顶端通常切割下顶端0.1mm叶原基的茎尖无菌水接种。

二、茎尖培养一般方法（茎尖分生组织）第9页,共40页，2024年2月25日，星期天（二）培养基多为MS培养基及其改良配方，还有White配方、B5配方、Heller配方、Gautheret配方等。第10页,共40页，2024年2月25日，星期天1.固体培养法特点琼脂做凝固剂，茎尖基部紧贴培养基。优点操作较为简单，普遍。缺点对有些植物培养较难。操作培养基分装——灭菌——冷却——茎尖接种——25±3℃培养。（三）培养方法第11页,共40页，2024年2月25日，星期天2.纸桥培养法滤纸取代琼脂，液体培养基。优点营养物质能均衡持久地供给外植体，利于外植体健康生长。缺点操作复杂。

第12页,共40页，2024年2月25日，星期天茎尖培养可进行植物的无性快繁，并且技术较为成熟，也叫微繁技术。三、普通茎尖培养与繁殖技术第13页,共40页，2024年2月25日，星期天（一）茎尖微繁技术的一般方法1.无菌培养体系的建立外植体制备正在生长的芽或腋芽、茎段、鳞茎切块、块茎、球茎。茎尖组织大小为带2-4个叶原基或更多。

操作程序类似一般无菌操作基本技术，基本培养基：MS、B5、White等，糖2-3%，生长调节剂。培养条件1000-3000Lx、16hr、25℃。第14页,共40页，2024年2月25日，星期天茎尖的发育方向及调节是采用生长调节剂，6-BA、KT等促进发芽，IBA、NAA、2,4-D促生根。培养的茎尖可能有几种不同的发育方向(1)腋芽萌发(2)脱分化后产生胚状体(3)脱分化后直接产生不定器官(4)脱分化后形成愈伤组织用作悬浮培养细胞或原生质体的起始材料，或用以分化大量胚状体，或不定芽.2.脱分化和再分化第15页,共40页，2024年2月25日，星期天3.生根成苗胚状体可直接成苗，腋芽和不定芽须转入生根培养基培养。矿质元素高利于茎叶生长，低利于生根，故生根培养基中无机盐低。芽苗生根采取的措施

(1)降低基本培养基无机盐浓度一般采用1/2MS或改良White基本培养基。(2)调节生长素浓度采用IBA或NAA0.1-0.5mg/L有利于分化根。(3)添加吸附剂如活性碳。(4)减少琼脂用量。第16页,共40页，2024年2月25日，星期天试管苗的移栽应在生根后不久，当小根尚未停止生长之前及时移栽。（小根5cm左右）。即将形成的小植株转移到土壤的过程。这个过程是微繁殖最关键的一步。⑴保持小苗水分供需平衡⑵选择适当的介质珍珠岩、蛭石、粗砂、炉灰渣、锯木屑等。⑶防止杂菌滋生保持环境干净，农药灭菌。⑷注意光温管理避免阳光直射、温度适宜。

4.试管苗的移植第17页,共40页，2024年2月25日，星期天(二)影响茎尖培养微繁殖的因素基因型外植体的大小供试植株的生理状态芽在植株上的部位供试植株的年龄培养基：植物生长物质褐变玻璃化玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。

第18页,共40页，2024年2月25日，星期天一、离体叶培养概念及意义1.离体叶培养概念指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等的无菌培养。

多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。第三节叶的培养桫椤叶片第19页,共40页，2024年2月25日，星期天⑴研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题的良好方法。

叶原基培养成为成熟叶，从而观察叶形态发生的过程。⑵通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。⑶通过离体叶组织、细胞的培养，探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素。⑷利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。⑸叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体应用于育种实践。

2.离体叶培养意义第20页,共40页，2024年2月25日，星期天（一）叶原基培养

叶原基培养是研究形态建成的重要手段。1.采用休眠期顶芽，剥去一部分鳞片。2.在5%次氯酸钠溶液中浸泡20min，进行表面消毒。3.切取柱状叶原基进行培养。

培养基采用Knop’s无机盐（部分修改）或Kundson（1951）配方（大量元素），添加Nitsch配方中的微量元素（再加CoCl225mg/L）2%蔗糖、pH5.5。部分实验中添加维生素、NAA、水解酪蛋白等，温度24℃，人工光照24h。

二、叶培养方法第21页,共40页，2024年2月25日，星期天第22页,共40页，2024年2月25日，星期天1.叶组织培养培养的方法（二）叶组织培养方法一（幼嫩叶片）选取植株顶端未充分展开的幼嫩叶片——流水冲洗——蘸有少量75%酒精的纱布擦拭叶片两面——放入0.1%升汞溶液中消毒5-8min——无菌水冲洗3-4次——消毒后叶片转入到铺有滤纸的无菌培养皿内——解剖刀切成0.5cm×0.5cm左右的小块或薄片（如叶柄和子叶）——上表皮朝上接在固体培养基上培养。第23页,共40页，2024年2月25日，星期天

70%酒精漂洗约10秒——饱和漂白粉液中浸3-15分钟——无菌水冲洗数次——放在无菌的干滤纸上吸干水分以供接种用。对一些粗糙或带绒毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。同一叶片的栅栏组织比海绵组织较成熟。培养叶肉组织时因海绵组织在分裂前就死亡，如果栅栏组织不发达就难培养。方法二（成熟叶片）第24页,共40页，2024年2月25日，星期天叶片愈伤组织诱导形成第25页,共40页，2024年2月25日，星期天常用MS、B5、White、N6等培养基，3%糖，培养基中添加椰子汁等有机添加物，有利于叶片组织培养中的形态发生。

大多数双子叶植物的叶组织培养，细胞分裂素特别是KT、6-BA有利于芽的形成，生长素特别是NAA有利于根的发生，2,4-D有利于愈伤组织的形成。一般6-BA1-3mg/LNAA0.25-1mg/L

2.培养基第26页,共40页，2024年2月25日，星期天25-28℃，光照12-14h，光照度1500-2000Lx，不定芽分化和生长期间3000-10000Lx。3.培养条件第27页,共40页，2024年2月25日，星期天⑴直接产生不定芽；⑵由愈伤组织产生不定芽；⑶胚状体形成；⑷其他途径。

叶片的分化程度较高，一般需要通过诱导愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较高。再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体再生的难度相当大。4.离体叶组织的茎和芽发生途径第28页,共40页，2024年2月25日，星期天5.影响叶肉组织培养的因素（1）基因型不同植物种类、同一物种的不同品种间在叶组织培养特性上有一定的差异。（2）细胞分裂素与生长素的组合两种细胞分裂素都能促进芽的分化，

6-BA的作用好于KT，但6-BA对不定芽的进一步发育（茎叶的形成）有抑制作用。细胞分裂素与生长素的组合细胞分裂素与生长素配合使用，诱导芽分化效果好于单独使用细胞分裂素。第29页,共40页，2024年2月25日，星期天（3）供试植株的发育时间和叶龄个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分化能力高，（4）叶脉叶脉、叶柄分化能力较强。（5）极性叶背面朝上放置就不生长。（6）损伤损伤后刺激诱导愈伤组织生长和器官发生。第30页,共40页，2024年2月25日，星期天一、根培养（一）根培养的实践意义1.进行根系生理代谢研究的最优良试验体系。2.研究器官分化、形态建成的良好体系。3.建立快速生长的根无性系，对药物生产有重要意义。4.对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体，用于育种实践。第四节其他器官的培养第31页,共40页，2024年2月25日，星期天1.培养步骤

离体根培养的第一步是要获得无性繁殖系。

直接取室外植物的根系培养；植物种子，经灭菌后，在无菌条件下发芽，获得无菌苗，取根培养。种子表面消毒——无菌条件下萌发——根伸长后切取1.0cm长的根尖——接种于培养基——侧根生长——切取侧根的根尖扩大培养——获离体根无性系（二）离体根的培养方法第32页,共40页，2024年2月25日，星期天胡萝卜根培养第33页,共40页，2024年2月25日，星期天在一个培养瓶中，有液体和固体培养两个组成部分：根尖部分处于液体培养中，而根茎部分则插入含有有机成分的固体培养基中。可进行根系生长发育，营养代谢或结瘤试验。2.离体根培养的试验系统第34页,共40页，2024年2月25日，星期天此装置由2个部分组成，下部是试管，管中装有含无机盐的营养液，并接种根瘤菌；上部是玻璃盖，盖中有一单向开口的管状凹槽，槽中盛放含有有机化合物的琼脂固体培养基。故有机营养从根基部吸收，无机营养从根尖吸收。Bunting和Horrocks1964年修改了Raggio等的装置，变为在粗沙中提供无机盐。利用这一技术研究菜豆、大豆等离体根根瘤菌的固氮情况，结果表明这些根瘤菌含有血红蛋白，并能固定大气中的氮。Raggio1965年等设计了离体根的结瘤实验装置。第35页,共40页，2024年2月25日，星期天离体根培养多用无机离子浓度低的White培养基或其他培养基，MS、B5等也可采用，但必须将其浓度稀释到2/3或1/2。（三）离体根培养所用的培养基成份苜蓿浓度(mg/L)西红柿浓度(mg/L)

Ca(NO3)2.4H2O200143.9Na2SO4200100KCl6540KNO382

NaH2PO4.2H2O18.610.6MgSO4.7H2O740368.5MnSO4.4H2O4.53.35FeC6H5O7.3H2O42.25ZnSO4.7H2O2.71.34H3BO31.50.75KI0.80.38CuSO4.5H2O0.0040.002MoO30.020.01甘氨酸34烟酸0.50.75维生素B10.10.1维生素B60.10.1蔗糖20000