链霉素反向筛选抗生素盒的构建及在鼠伤寒沙门氏菌基因敲除中的试用的开题报告_第1页
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链霉素反向筛选抗生素盒的构建及在鼠伤寒沙门氏菌基因敲除中的试用的开题报告开题报告题目：链霉素反向筛选抗生素盒的构建及在鼠伤寒沙门氏菌基因敲除中的试用一、研究背景与意义抗生素反向筛选法是基于抗生素的机制和对微生物生长的影响，利用代表性的抗生素来筛选突变库、基因敲除库中的相关基因或突变体，从而发现其对抗生素敏感或耐药性的影响。链霉素是一种广谱抗生素，广泛应用于临床和兽医领域，具有重要的药用价值。然而，链霉素的滥用和不合理使用已导致链霉素耐药菌株的出现，严重威胁人类健康。因此，探究链霉素的作用机制以及寻找治疗链霉素耐药菌株的新途径具有重要的理论和实践意义。本研究旨在构建链霉素反向筛选抗生素盒，利用该抗生素盒筛选鼠伤寒沙门氏菌中与链霉素敏感性相关的基因，为揭示链霉素作用机制、发现抗耐药菌株的新途径提供实验支持。二、研究内容1.构建链霉素反向筛选抗生素盒本研究将设计并合成覆盖鼠伤寒沙门氏菌基因组的一系列DNA序列，然后在序列的端部引入Linker序列，再通过连接链霉素与Linker序列，形成链霉素反向筛选抗生素盒。2.鼠伤寒沙门氏菌基因组插入突变和筛选a.将链霉素反向筛选抗生素盒随机插入鼠伤寒沙门氏菌基因组中，并构建突变库。b.将突变库分别在含/不含链霉素的培养基中进行培养，并通过高通量筛选技术鉴定链霉素抗性株。c.通过测序确定链霉素抗性株感兴趣的基因区域。d.根据基因区域设计引物，构建基因敲除库，利用该库筛选链霉素敏感株。三、研究方案与方法1.实验材料鼠伤寒沙门氏菌菌株、细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA合成试剂、Linker、链霉素、PCR试剂盒、RNase-FreeDNaseI、pKD46等。2.实验流程a.实验前，从鼠伤寒沙门氏菌菌株中提取基因组DNA。b.设计链霉素反向筛选抗生素盒的DNA序列，引入Linker序列，连接链霉素，形成抗生素盒。c.利用PCR扩增抗生素盒，并通过RNase-FreeDNaseI消除残留的DNA。d.把抗生素盒随机插入鼠伤寒沙门氏菌基因组中，构建突变库。e.在含/不含链霉素的培养基中培养突变库，并通过高通量筛选技术鉴定链霉素抗性株。f.根据测序结果，确定感兴趣的基因区域，设计引物并构建基因敲除库。g.利用基因敲除库筛选链霉素敏感株。四、预期结果1.成功构建链霉素反向筛选抗生素盒，突变库及基因敲除库。2.筛选出与链霉素敏感性相关的鼠伤寒沙门氏菌基因，揭示链霉素的作用机制以及发现对治疗链霉素耐药菌株具有新价值的药物或治疗方法。3.探索并建立新的突变体筛选平台，在微生物学和相关领域中具有较大的应用前景。五、研究进度目前已完成链霉素反向筛选抗生素盒的设计和合成，细胞培养和基因编辑实验正在进行中。预计在2022年完成实验，并得到相关实验结果。六、研究重点和难点研究的重点是构建链霉素反向筛选抗生素盒，实现对基因敲除

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