木质素降解研究

本科毕业论文木质素降解的研究LIGINIDEGRADATIONOFRESEARCH学院〔部〕：化学工程学院专业班级：学生姓名：指导教师：2012年3月26日木质素降解的研究摘要评述了木质生物降解的最新研究进展，主要包括木质素的生物降解机制、降解木质素的微生物种类及其产生的相关酶类、微生物的代谢调控和分子生物学。此外，对木质素降解生物的实际应用和应用前景也进行了评论。关键词：木质素；生物降解；秸杆；白腐真菌；环境保护LIGINIDEGRADATIONOFRESEARCHABSTRACTThequalityofthewoodthatthesolutionoftheborndownnewgrindinvestigateintotheexhibition,TheLordwillincludingwoodgrainlifequalitythatmachinesystem,dropdownsolutionofgrainofwoodsolutionmicroscopicthingskindofclassanditsproductionwasbornofenzymeinclose,microscopiccontentofthegenerationxthecontrolandpointsthesonborntolearnthings.Theoutside,towoodqualitygraindropsolutionwhichshallbebornofborderwithandshouldbebeforeusingthescenealsointothelineevaluationtheory.KEYWORDS：woodqualitativeelement;Borncontentdropsolution;Strawpole;White-rotfungusreally;Theenvironmentthecare目录摘要-2-绪论-1-1．简介-2-1.1根本概念-2-1.2单体与结构-3-1.3开展前景-3-2.木质素的降解简略-4-2.1概况-4-2.2木质素的结构特点-4-3.木质素降解微生物的种类-5-3.1三种重要木质素降解酶-5-I．木质素过氧化物酶(LiP)-5-II．锰过氧化物酶(MnP)-7-III．漆酶-9-3.2三种木质素降解酶协同作用-10-4应用全景-10-4.1木质素降解酶的全景-10-4.2木质素降解酶的特性-12-4.3木质素的降解微生物的酶活性调控机理-13-4.4木质素的生物降解的应用-16-结论-17-参考文献-18-谢辞2绪论木质素资源十分丰富，是植物光合作用制造的总量仅次于纤维素的有机化合物，估计全球的木质素年产量可达1500亿t。然而，木质素资源并没有得到有效的利用，大量的木质素作为造纸工业的副产物而排放，不仅是资源的一大浪费，而且严重污染环境。采用物理和化学处理法，可减少约50%的木质素排放，但治理本钱高，易造成二次污染。利用生物技术降解木质素，可以减少环境污染，变废为宝，实现资源再利用。因此，认识木质素的结构特点和了解其生物降解的研究进展，对于木质素资源的合理化利用将具有一定的指导意义。1．简介1.1根本概念木质素〔lignin〕是由四种醇单体〔对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇〕形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。在植物组织中具有增强细胞壁及黏合纤维的作用。其组成与性质比拟复杂，并具有极强的活性。不能被动物所消化，在土壤中能转化成腐殖质。如果简单定义木质素的话，可以认为木质素是对羟基肉桂醇类的酶脱氢聚合物。它含有一定量的甲氧基，并有某些特性反响。木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用。在木本植物中，木质素占25%，是世界上第二位最丰富的有机物(纤维素是第一位)。1.2单体与结构\o"查看图片"木质素单体的分子结构木质素是由四种醇单体〔对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇〕形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。木质素是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。因单体不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素〔syringyllignin，S-木质素〕，由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素〔guajacyllignin，G-木质素〕和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素〔hydroxy-phenyllignin，H-木质素〕；裸子植物主要为愈创木基木质素〔G〕，双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素〔G-S〕，单子叶植物那么为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素〔G-S-H〕。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质，并使这些细胞具有特定显色反响〔加间苯三酚溶液一滴，待片刻，再加盐酸一滴，即显红色〕的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。木质素在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中那么很少见含有。一般存在于豆类、麦麸、可可、巧克力、草莓及山莓的种子局部之中。其最重要的作用就是吸附胆汁的主要成分胆汁酸，并将其排除体外。1.3开展前景随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入,天然高分子所具有的可再生、可降解等性质日益受到重视。废弃物的资源化与可再生资源的利用,是当代经济与社会开展的重大课题,也是对当代科学技术提出的新要求。在自然界中,木质素的储量仅次于纤维素,而且每年都以500亿吨的速度再生。制浆造纸工业每年要从植物中别离出大约1.4亿吨纤维素,同时得到5000万吨左右的木质素副产品,但迄今为止,超过95%的木质素仍以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉,很少得到有效利用。化石能源的日益枯竭、木质素的丰富储量、木质素科学的飞速开展决定木质素的经济效益的可持续开展性。木质素本钱较低，木质素及其衍生物具有多种功能性，可作为分散剂、吸附剂/解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂，木质素对人类可持续开展最为重大奉献就在于提供稳定、持续的有机物质来源，其应用前景十分广阔。研究木质素性能和结构的关系，利用木质素制造可降解、可再生的聚合物。木质素的物化性能和加工性能、工艺成为目前木质素研究的障碍。2.木质素的降解简略2.1概况2.2木质素的结构特点木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键联接的复杂的无定形高聚物，，难以被酸水解，是天然高聚物中最难搞清楚的一个领域’其原因有两个方面，一是木质素的结构单元之间除醚键联接外还有C—C键；另一方面是不可能把整个木质素分子以其完整状态别离出来。典型木质素是由松柏醇〔Coniferyalcohol〕，芥子醇〔Sinapylalcohol〕和对—香豆醇〔p-Coumarylalcohol〕〕这3种不同的醇作为先体结构物质组成根本的结构单元，这些木质素结构单元常常以它们的糖苷形式贮存在细胞中，一旦需要合成木质素，它们便从这些糖苷中释放出来’这些木质素结构单元之间主要是通过醚键和碳碳键的方式联接%醚键包括酚醚键、烷醚键和二芳醚键。在酚醚键中愈创木基-甘油-β-芳基醚键〔β-0-4〕数量最多，占酚醚键的1/2左右，其次是愈创木基-甘油-α-芳基醚键〔β-0-4〕。而木质素的C-C键的连接类型主要有β-5，β-β，β-1，β-2和5-5.3.木质素降解微生物的种类3.1三种重要木质素降解酶木质素是造纸工业排放黑液COD和色度形成的主要原因,其结构是由甲氧基取代的对-羟基肉桂酸聚合而成的异质多晶三维多聚体,分子间多为稳定的醚键、C-C键,是目前公认的微生物难降解芳香化合物之一。自1934年Boruff和Buswell首次发现能降解木质素的微生物种群,人们对木质素的生物降解进行了大量研究,1983年和1984年发现了木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP),由日本吉田首次在生漆中发现的漆酶(Laccase),也始终引起着人们的关注。这三种酶被公认为是木质素重要的降解酶。=1\*ROMANI.木质素过氧化物酶(LiP)=1.1\*ROMANI.=1.1\*ROMANI分布及种类LiP是第一个从黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)发现的木质素降解酶,在木质素降解中起关键性作用。LiP的产生菌在自然界分布相当广泛,许多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以产生LiP,主要产生菌见表1=1.1\*ROMANI.=2\*ROMANII结构及特点LiP代表一系列含Fe3+、卟啉环(IX)和血红素附基的同工酶,由不同微生物产生的酶的种类和理化性质各不相同。LiP是一种带有糖基的胞外血红蛋白,晶体结构已有报道,确定血红素(heme)埋在蛋白质内,可连接至少一个VA。木质素大分子不能接近该酶的活性中心,其结合位点是一段有序的糖残基,位于接近活性中心通道外表的裂缝中。光谱学研究说明LiP有五种氧化状态,自然状态LiP含有高自旋Fe3+,被H2O2氧化两个电子后形成LiP=1\*ROMANI(氧带铁卟啉环自由基含+Fe4+),LiP=1\*ROMANI经单电子复原形成LiP=2\*ROMANII(氧带铁卟啉环含Fe4+),再经一次单电子复原,回到自然状态,His82在活性中心通道外表的裂缝的开口处,Trp170在酶蛋白外表,其电子传递可能有两个不同的途径:底物-His82-Ala83-Asn84-His47-Heme或底物-Trp170-Leu171-Heme。LiP的特点是能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物,在通过电子传递体攻击木质素时,它能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子,将其氧化成自由基,继而以链式反响产生许多不同的自由基,导致木质素分子中主要键断裂。此过程需要H2O2的驱动,反响如下:LiP+H2O2→LiP=1\*ROMANI+H2OLiP=1\*ROMANI+SH2→SH+LiP=2\*ROMANIILiP=2\*ROMANII+SH2→SH+LiP2SH·+2木质素→2木质素自由基+2SH2其中,SH2为专一电子传递体。H2O2可由白腐菌胞内H2O2产生酶系产生,且其胞内还存在过氧化物水解酶,保证其不会受到毒害。=1.1\*ROMANI.=3\*ROMANIII作用机制木质素分子间主要键型是β-O-4,β-O-4模式复合物中有A,B两个苯环,均可被LiP氧化。LiP催化β-O-4模型物的主要反响是Cα-Cβ断裂形成VA和2-甲氧基苯酚。另一个重要的分支反响是Cα-氧化产物的形成,结果说明:Cα-氧化产物是酚型Cα-氧合芳香化合物时,可由漆酶催化,酚氧化酶介导的氧化反响降解;当Cα-氧化产物是非酚型Cα-氧合芳香化合物时,由于其非各种氧化酶的底物,氧化降解非常困难。VA是LiP的诱导剂,还可以保护LiP不受H2O2的损害。对VA的氧化目前认为主要是由LiP催化,过氧化氢离子和H2O同时参与芳香环的开裂。开环产物可被进一步代谢CO2。整个反响中生成的甲氧基酚衍生物,由LiP和漆酶共同氧化,形成醌,在纤维二糖/醌复原酶系、芳香环开裂酶系的协同作用下,生成酚,最后形成环开裂产物,进入Kerb循环,或者纤维二糖酸内脂的形式进入磷酸戊糖途径,最终代谢为CO2。而非酚型的芳香醛酸,由于其氧化复原电位太高,需先被芳香醛酸复原酶复原成相应的醇,然后才能被LiP氧化成开环产物或醌。在木质素的模式复合物中,已被深入研究的还有β-1型,LiP氧化其它键型如β-5、β-O-4模式复合物,产物尚未被证实。=1.1\*ROMANI.=4\*ROMANIV基因结构及表达在分子生物学领域,研究较多的是P.chrysosporium、Trametesversicolor、Bjerkanderaadusta等。在P.chrysosporium中已经克隆出至少7个相近的LiP基因家族,定名为LiPA-LiPJ,同源性很高。核型分析说明,异源真核菌株约含10个染色体,而LiP基因至少被分布在两个染色体上。LiP序列排列紧密且高度保守,氨基酸相似性53%~98%,每个LiP基因编码一个由343~345个氨基酸组成的成熟蛋白质,分子量约36360~36607Da。N端有一个21个氨基酸的信号肽,且有6或7个氨基酸的前体肽。已测序的LiP基因均含有8或9个内含子,大小49~78bp,5'端非编码区包含一个TATA框(-66~-81bp)和一个CAAT框(-107~-228bp)的调节序列。在基因表达方面,其转录明显受到C,N水平的影响,LiP的同工酶种类和数目随培养条件变化而改变,至少有五种:H1、H2、H6、H8、H10。其分子量大小、等电点、光谱特性、稳定性均有差异,N端氨基酸序列也不相同。非限制性N源条件下,H8是主要的同工酶,其cDNA序列被命名为ML-1,H2的表达也稍占优势,但H6的表达较限制性N源条件下大大下降。在异源表达上,已得到许多重组LiP,但重组LiP的功能有所改变,如催化能力改变,不再受Mn2+抑制等。=2\*ROMANII锰过氧化物酶(MnP)=2\*ROMANII.=1\*ROMANI分布及种类MnP与LiP一样,都是代表一系列带有糖基的胞外过氧化物酶,因二者都含有血红素,又称血红素过氧化物酶。MnP的主要产生菌见表2,主要是一些白腐真菌,多属担子菌亚门,无隔担子菌亚纲,无褶菌目的多孔菌科。=2\*ROMANII.=2\*ROMANII结构及特点MnP的晶体结构中包括17%的中性糖类和大量酸性氨基酸,血红素上仅有一个Mn2+的结合位点,MnP能将其氧化,消耗一分子的H2O2,产生两分子的Mn3+。Mn3+从MnP上脱离后,如果没有适宜的螯合物与其结合,保证其稳定性,其可以在溶液中发生反响,生成MnO2。在木质素降解过程中,MnO2可保护LiP免受H2O2的损伤。而在LiP-MnP组合酶体系中,高浓度的Mn2+或Mn3+,加上适宜的螯合物,会导致LiP的抑制,MnP的诱导。可见,Mn对LiP和MnP都具有重要的作用,且作用大小与猛离子的浓度及添加时间有关。MnP的特点是只能氧化酚型木质素。氧化苯酚的过程中,MnP和H2O2的启动下,氧化Mn2+为Mn3+,然后,Mn3+氧化苯酚生成苯氧残基。这与LiP氧化苯酚的方式有明显不同。=2\*ROMANII.=3\*ROMANIII作用机制MnP降解木质素的作用机制尚不清晰,目前认为是一个循环催化过程见图1,AH代表酚型底物。随着研究的逐渐深入,它在木质素降解过程中的作用越来越受到重视。=2\*ROMANII.=4\*ROMANIV基因结构及表达从P.chrysosporium的胞外液中别离出至少六种MnP的同工酶,均由多基因编码。通过全部RNA的反转录PCR,能得到MnP的三个不同基因的mRNA:MnP1、MnP2、MnP3。静置培养条件下,MnP2是主要的MnP表达基因,而搅拌培养时,MnP1是主要的表达基因,MnP3的表达较稳定。MnP基因有6或7个内含子,N端有21或24个氨基酸的信号肽,但无前体肽。活性位点附近的序列非常保守,MnP的5非编码区包括1个TATAA单元(-81bp)及3个反向的CCAAT单元。启动区包括大量热休克元件和序列,这些元件与哺乳动物金属硫蛋白基因中的金属调节元件相同[4~5]。在基因表达方面,MnP的产生明显依赖Mn2+浓度、培养基、热休克、C和N源变化,且调节是在转录水平上。菌株P.chrysosporiumOGC101MnP1编码一个357个氨基酸的成熟蛋白,内含子6个,大小57~72bp。=3\*ROMANIII漆酶=3\*ROMANIII.=1\*ROMANI分布及种类1883年漆酶被首次发现,一百多年来,人们通过大量研究发现漆酶广泛存在于多种植物和菌类的分泌物中。在真菌中,漆酶大多分布在担子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、柄孢壳菌(Podospora)等中。此外,一些动物肾脏和血清中也发现了漆酶,近来,人们发现一些细菌也能产生漆酶[6],如生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)。漆酶的主要高产白腐真菌王佳玲等曾作过统计。=3\*ROMANIII.=2\*ROMANII结构与特点漆酶的分子量在64~390kD之间,除Podosporaanserina产生的一种漆酶是四聚体外,其它漆酶一般是单一多肽,由约500个氨基酸组成。不同种类的漆酶含铜数并不相同。一般含有四个铜离子,根据光谱和磁性特征可分为三类:=1\*ROMANI型Cu2+一个,单电子受体,顺磁性,蓝色,λ614nm处有特征吸收蜂;=2\*ROMANII型Cu2+一个,单电子受体,顺磁性,非蓝色,无特征,吸收光谱;=3\*ROMANIII型Cu24+两个,双电子受体,反磁性,是偶合的离子对(Cu2+-Cu2+),λ330nm处有宽的吸收带。漆酶的三维结构尚不清晰,但证实铜离子位于酶的活性部位,在催化氧化过程中起决定性作用。漆酶是单电子氧化复原酶,据统计它催化氧化的底物达250多个,最重要的是酚及其衍生物,约占其底物总数的一半。此外漆酶还能催化芳胺、羧酸及其衍生物,甾体激素和其它非酚类底物,如抗坏血酸等。=3\*ROMANIII.=3\*ROMANIII作用机制漆酶是一类以O2为电子受体的蛋白酶,对其作用机理,目前研究较透彻的是其催化多酚化物如氢醌,此过程须经过四次单电子传递。首先,底物氢醌向漆酶转移一个电子,生成半醌-氧自由基中间体。而后,两分子半醌生成一分子氢醌和一分子苯醌,氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体,它们可以相互结合或相互偶连,故在菌体内,漆酶与其它氧化木质素酶系协同降解木质素。而在体外实验中,木质素单体在Laccase/O2条件下会发生聚合反响。O2存在条件下,复原态漆酶被氧化,O2被复原成水,此过程是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的:Cu2+Cu2+Cu24+→2e底物→Cu+Cu+Cu24+→分子内电子转移→Cu2+Cu2+Cu22+→2e底物→Cu+Cu+Cu2+→2H+O2H2O快→Cu2+Cu2+(Cu2O)3+→2H+H2O慢→Cu2+Cu2+Cu24+=3\*ROMANIII.=4\*ROMANIV基因结构及表达漆酶是由一个结构相近的基因家族编码,许多真菌的漆酶基因已被克隆和测序,如Agaricusbisporus、Neurosporacrassa。从Coprinuscinerens中克隆出3个漆酶基因Lcc1、Lcc2和Lcc3。其中Lcc1含7个内含子,大小为54~70bp,成熟蛋白约521个氨基酸,有三个潜在的N-连接糖基化位点,C端有23个氨基酸的延伸序列,富含Arg和Lys,其酶蛋白成熟至少需剔除信号肽、前体肽和C端延伸区。Lcc2和Lcc3均有13个内含子,表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80%。Lcc3和Lcc1的氨基酸同源性58%,Lcc2和Lcc1的氨基酸同源性59%,而Lcc3与Aspergillusnidulan漆酶的氨基酸同源性只有18%。因此,异源真菌漆酶之间的氨基酸同源性较低,但在铜结合区具有较高保守性。在异源表达上,曲霉是一个很好选择,A.oryazeTATAamylase和Pichiapasti系统已成功表达假设干不同来源的漆酶,Lcc1在米曲霉中表达成功,90%以上的转化体表现出漆酶活性,目前,已有许多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表达。3.2三种木质素降解酶协同作用对上述三种酶的研究主要集中在液体培养方式上,结果显示采用静置培养,深层培养利于酶的产生。已证明,木质素降解酶活性受C源、N源、微量元素、诱导物、培养温度和pH值等因素影响。而P.cinnabarinus的漆酶产量却不受一些小分子芳香化合物的诱导。确定单一一种酶在木质素降解中的功能非常困难,因为每一种白腐菌所产生的都不是一种木质素降解酶,如Laccase和MnP单独存在都不能很好的降解木质素,而两种酶同时存在时,木质素却能得到很好降解,说明两种酶具有协同作用。有趣的是当体系中一些条件变化时,体系中的两种或几种木质素降解酶会发生相互抑制现象,如液体培养条件下,Mn2+浓度增加会导致LiP活力大大降低,而MnP和Laccase的活力却相应增加,这启示我们这种协同作用可能存在正负两种机制。不同白腐菌木质素降解酶系的组成大不相同,可分为四类:LiP-MnP,如P.chrysosporium;LiP_MnP_Laccase,如Trametesgibbosa;MnP_Laccase,如Lentinulaedodes;LiP_Laccase,如Pleurotusostreatus。最新研究说明,不同降解酶系成分之间的比例将直接影响木质素降解效果。各种酶系具体如何分工协作降解木质素,尚不清楚,将是今后研究的一个热点。4应用全景4.1木质素降解酶的全景在自然界中，能降解木质素并产生相应酶类的生物只占少数。木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果，其中真菌起着主要作用。降解木质素的真菌根据腐朽类型分为：白腐菌———使木材呈白色腐朽的真菌；褐腐菌———使木材呈褐色腐朽的真菌和软腐菌。前两者属担子菌纲，软腐菌属半知菌类。白腐菌降解木质素的能力尤于其降解纤维素的能力，这类菌首先使木材中的木质素发生降解而不产生色素。而后两者降解木质素的能力弱于其降解纤维素的能力，它们首先开始纤维素的降解并分泌黄褐色的色素使木材黄褐变，而后才局部缓慢地降解木质素。白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，因此被认为是最主要的木质素降解微生物。目前，研究最多的白腐菌有：黄孢厚毛平革菌(Phanerochetechrysosporium)、彩绒草盖菌〔Coridusversicolor〕、变色栓菌〔Thametesversicolor〕、射脉菌〔Phlebiaradiata〕、凤尾菇〔Pleurotuspulmononanus〕、朱红密孔菌〔Pycnoporuscinnabarinus〕等.这些菌多属于担子菌亚门，无隔担子菌亚纲、无褶菌目的多孔菌科.王佳铃等曾评述过1981～1995年间研究报道过的主要高产漆酶白腐真菌〔表1〕。褐腐菌的软腐菌中的有些种类也可以分泌一些降解木质素的酶类，但它们分解木质素的能力不是很强，因此，研究报道较少.降解木质素的原核生物以放线菌为主，如链霉菌属〔Streptomyces〕、节杆菌属〔Arthrobaeter〕、小单孢菌属〔Micromonoyticum〕和诺卡氏菌〔Nocardia〕等。细菌中有厌氧梭菌〔Clostridumxylanoyticum〕、假单孢菌〔Pseudomonas〕、不动杆菌〔Acinetobacter〕和芽孢杆菌〔Bacillus〕等原核生物对于在土壤中木质素的转化和降解具有重要作用，但土壤中木质素的降解据报导是土壤微生物区系多种类型微生物协同进行的结果，而且进程缓慢，单一微生物纯培养的商业用途前景不很清晰，且这类原核生物的多酚氧化酶是胞内酶，这也决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对附属的地位.此外，很多植物病原微生物如RhizoctoniasolaniR.praticola等也具有分解木质素的能力，但这类微生物在处理秸秆上的应用前景不大.在木质素降解微生物中，研究得最多最彻底和最具应用前景的是黄孢原毛平革菌。这种微生物的特点是培养温度高〔37℃左右〕，无性繁殖迅速，菌丝生长快且分泌木质素降解酶能力强，它已经成为研究白腐真菌的一种模式微生物’它的培养条件、代谢调控、分子生物学和遗传学及其在生产实践上的应用等均已被研究的相当仔细。4.2木质素降解酶的特性目前，关于木质素降解酶的研究工作主要集中在白腐菌所产生的酶系。研究得较多，并认为最为重要的木质素降解酶有3种，即木质素过氧化物酶〔Ligninperoxidases/Lip〕、锰依赖过氧化物酶〔Manganeseperxidases/Mnp〕和漆酶〔Laccase〕.LiP,MnP和Laccase只是分别代表一系列的同功酶。但各种微生物所产生的酶的种类和一些理化特性是有所不同的。其中LiP是第一个从黄孢原毛平革菌发现的木质素降解酶，以后又分别从射脉菌，彩绒革盖菌，变色栓菌中发现.Laccase没有在黄孢原毛平革菌中发现，而在Phlebia,Trametes,Coriolus等菌中发现。木质素的降解酶系是非常复杂的一个体系，很多问题至今还不十分清楚.除了上述3种重要的酶外，其它的一些酶如芳醇氧化酶〔AAO〕、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及一些复原酶、甲基化酶和蛋白酶等都参与或对木质素的降解产生一定的影响.LiP和Mnp都是带有糖基的胞外血红素蛋白.又称血红素过氧化物酶〔HemePeroxidase〕，它们在反响中从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子而使后者形成一个阳离子基团，从而导致木质素分子中主要键的断裂.LiP主要是氧化苯酚使之成为苯氧残基.Mnp主要是从Mn2+和H2O2的氧化中得到Mn3+，然后Mn3+氧化苯酚使之成为苯氧残基’而每种酶在木质素降解中的具体作用还不甚清楚.漆酶〔Laccase〕是含铜的多酚氧化酶，主要来源于生漆和真菌。由于Laccase的含糖量高，难得到X-衍射分析用的漆酶单晶，它的三维空间结构尚不清楚.但已经证实，漆酶中的铜离子在催化氧化反响中起决定作用.根据磁学和光谱性质可将漆酶中的4个铜离子分为3类：=1\*ROMANI型Cu2+和=2\*ROMANII型Cu2+各1个，是单电子受体，呈顺磁性，可以用核磁共振控测；=3\*ROMANIII型Cu2+2个，是双电子受体，反磁性，用核磁共振不能检测.!=1\*ROMANI型Cu2+呈蓝色，在λ614nm特征吸收峰；=2\*ROMANII型Cu2+为非蓝色，没用特征吸收峰；=3\*ROMANIII型Cu24+的离子对〔Cu2+…Cu2+〕，在30处有宽的吸收峰.在木质素降解过程的机制和作用至今人们还不完全清楚。作为一种多酚氧化酶，它可催化氧化酚类或芳胺类等多种底物的氧化作用。氧化酚或芳胺先失去一个电子生成自由基，后者发生一系列非酶反响，氧化成醌，在有O2存在时，复原态漆酶被氧化，O2复原成水’底物自由基不稳定，可进一步发生键的断裂或生成，导致裂解或聚合反响。因此，底物分子可进一步合生成复杂的产物，也可催化芳香环支链Cα-Cβ断裂。GALIANO等发现，当Laccase和MnP分别单独存在时，都不能有效地降解木质素，而2种酶同时存在时那么木质素得到有效的降解，这说明2种酶在催化木质素生物降解反响中具有协同作用.此外还发现在反响中参加其它的酶，如葡萄糖氧化酶时，可显著提高木质素的降解程度.他们认为，这是由于Laccase既有解聚，又有聚合木质素的能力，参加葡萄糖氧化酶可原Laccase氧化多酚产生的醌等阻止木质素的聚合作用，从而提高Laccase的降解能力.确定每一种酶在木质素降解过程中的作用和功能是困难的，因为至少目前木质素被微生物所产生的单一胞外酶彻底、完全地催化解聚和降解的情况还没被发现.每一种白腐真菌所产生的都不只是一种能降解木质素的酶，在缺陷任一种酶的体系中木质素仍能够较好的降解，而这些酶之间又相互作用和影响，使其存在于一个协同作用体系中.虽然现在已能用14C标识的合成木质素来研究木质素降解酶在木质素降解中的作用机理，但由于木质素的结构复杂，木质素的彻底降解需依赖微生物区系中多种微生物在较长时间内相互交替的生长繁殖才能完成.4.3木质素的降解微生物的酶活性调控机理在白腐菌产酶的培养方式上，研究最多的是液体培养.国内外曾利用多种不同有机、无机或复合碳源和氮源来研究它们对微生物的木质素降解能力和产酶能力的影响.还研究了碳源或氮源限制对它们的影响.结果说明，碳源和氮源是微生物降解木质素和产酶的一个极为重要的影响因素.不同的单糖、双糖作碳源的矿质培养基培养豹斑革菌时，用麦芽糖生物的生长量最高.标准培养条件下，以葡萄糖作对照，甘露糖和麦芽糖使MnP分别增2倍和3.8倍。酵母汁、牛肉膏等复合氮有利于LiP活性的提高，而甘氨酸、柠檬酸铵、乙醇胺等那么抑制LiP的生成和活性.毛平革菌等白腐菌的木质素降解和木质素降解酶的产生是发生在氮源或其它营养被消耗的次级代谢过程中.而细菌那么与之相反，高浓度的有机或无机氮源都不能抑制木质素降解，所产生的过氧化物酶也具有与生长相联和不受高水平氮抑制的特点.我国学者李越中等曾对黄孢原平革菌合成木质素过氧化物酶的营养调控进行过较为详细的研究报道〔表2、表3〕。微量元素对于白腐菌相关酶类的产生是有较大影响的。漆酶是一种含铜的多酚氧酶，因此，Cu对于漆酶的产生和酶活性是相当重要的Mn对LiP和MnP都具有重要的作用，对漆酶的影响也是显著的.BINNARME等认为，Mn2+对LiP有抑制作用，而对MnP那么有诱导作用，其作用的大小与Mn2+的浓度及添加时间有关.C.subuermispora在Mn2+浓度为11×10-6mol·L-1时，木质素矿化速率最大，而MnP和Laccase的活性在4.0×10-6mol·L-1时最高.不添加Mn2+可使Agaricuscampestris的Laccase活性显著降低，但Mn2+对其影响是以Cu2+的存在为前提，如果没有Cu2+存在，那么Laccase的活性那么与Mn2+浓度无关且酶活性始终很低.有报道，高浓度的Mn2+会提高Phlebiabreispora的Laccase活性，但对Dichomitus来说，Laccas活性都不受Mn2+的影响.结构和木质素有关的低分子芳香化合物或木质素降解的碎片化合物，可诱导Laccase产生并提高其酶产量，这类化合物如香草酸、藜芦醇、愈创木酚、吐温、甲苯胺等.在豹斑革耳菌上还发现了专一的MnP诱导物3-甲基苄醇.培养温度、通气状况，PH值乃至环境湿度等，也是影响木质素降解酶产生的因素.如黄孢原毛平革菌的最适生长温度为37℃，最适产酶温度为30℃豹斑革耳菌增加通气可使木质素矿化率有所提高，而对于Phlebiaradiata来说，通氧那么抑制其酶活性.培养温度和PH值对Laccas的影响因具体菌种而异，不同的菌种有不同的适宜培养温度和PH值.4.4木质素的生物降解的应用木质素的生物降解目前成功地用于生产实践的实际应用尚不多见，但在有些方面的研究已经显现出诱人的前景.1)造纸工业分解木质素的酶类在造纸工业上的应用有两个方面，一是用改造旧的造纸工艺，用于生物制浆、生物漂白和生物脱色-黄孢原毛平革菌和P.brevispora等在国外已经得到成功利用-如用P.brevispora进行生物制浆预处理可降低47%的能耗并增加了纸浆的张力，但它们的木质素降解率和产酶量都还是极为有限的，处理时间过长，距大规模推广应用尚有一定的距离.二是木质素分解菌或酶类用于造纸废水的处理，这方面的国内外研究报告已有很多且已取得了一定的实效.2)饲料工业木质素分解酶或分解菌处理饲料可提高动物对饲料的消化率-实际上，木素酶和分解菌的应用已经突破了秸秆仅用于反刍