化学工艺学：生物物质分离纯化

第六节生物物质分离纯化一些天然存在以及通过各种生物反应过程产生的物质，涉及从低分子化合物到具有复杂结构和功能的生物组织，包括氨基酸、糖类、脂质、抗生素、多肽和蛋白质等。生物物质生物产品分离的流程可概括为：

产品捕获粗分离纯化及精制返回生物产品尤其是蛋白质类生物大分子具有如下特点：①目的产物在原料液中的含量很低，有时甚至是极微量的；②含目的产物的初始物料组成复杂，除了产物外，还含有大量的细胞、代谢物、残留培养基等；③生物活性物质的稳定性差，易失活、变性；④生化产品种类繁多，包括了大、中、小相对分子质量的结构和性质复杂又各异的生物活性物质；⑤生物产品一般用于食品、化妆品和医药，与人生命息息相关，对含量和纯度要求高等特点。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化生物产品的分离纯化技术须满足的要求：①分离条件温和，特别对具有生物活性的物质，在分离纯化过程中必须保持其生物活性，避免其失活；②分离纯化技术的选择性好、专一性强，能从复杂的混合物中有效地将目标产物分离出来，以达到较高的分离纯化倍数；③在提高单个分离技术的效率的同时，注意各操作间的有效组合和整体协调，尽可能地减少工艺过程的步骤，增加每一步的收率。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化生物产品分离纯化的一般步骤及主要分离纯化技术的基本原理

生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化1生物物质分离的纯化方法萃取法有机溶剂萃取法原理：依靠在水和有机溶剂中的分配系数的差异进行分离。特点：适用于有机化合物及结合有脂质或非极性侧链的蛋白质等的分离。其中反胶团系统较适合于生物活性物质的萃取。缺点：萃取条件严格，安全性低，活性收率低。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化双水相萃取法原理：依据目的物在不相溶的聚合物或无机盐溶液形成的两相中的分配系数不同而进行分离特点：可连续或批式操作，设备要求简单，萃取容易，操作稳定，极易放大。适合于大规模应用。将离子交换基团、亲和配基、疏水配基等结合在聚合物分子上可改进分配系数及萃取专一性缺点：成本较高，纯化倍数较低，适合于粗分离生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化反胶团萃取法原理：利用表面活性剂形成的“油包水”微滴，对蛋白质等进行分离特点：有一定的选择性，操作简单，萃取能力大缺点：表面活性剂筛选工作量大，目前还缺乏应用实例生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化凝胶萃取法原理：利用凝胶可发生可逆、非连续的溶胀和皱缩以及对所吸收的液体具有选择性的性质进行物质分离特点：设备简单、能耗低、再生容易，有良好的应用前景缺点：目前还处于实验室研究阶段生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化超临界流体萃取原理：利用某些流体在高于其临界压力和临界温度时形成的超临界流体作为溶剂进行萃取特点：萃取能力大、速度快，可通过控制温度和压力改变对某些物质的选择性缺点：操作压力大，目前大规模应用的例子不多，但研究十分活跃生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化有机溶剂沉淀法原理：利用有机溶剂破坏蛋白质分子的水化层，使之聚集成更大的分子而沉淀特点：可用于沉淀各种蛋白质，可实现分级沉淀，达到粗分离和浓缩的目的，应用较广、简便缺点：需低温下进行，沉淀时会发生蛋白质变形失活沉淀法生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化盐析法原理：利用无机盐破坏蛋白质分子的水化层，中和表面电荷，使之聚集成更大的分子团而沉淀特点：可用于蛋白质分级沉淀或沉淀、粗分离及浓缩作用，对生物活性有一定的保护作用，方法简便，可大规模应用缺点：蛋白质的回收率一般，产生的废水含盐高，对环境有较大影响生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化等电点沉淀法原理：利用带电物质在等电点时溶解度最小的原理，在低的离子强度下，调节pH至等电点，使蛋白质等所带电荷为零，使蛋白质等物质沉淀出来，从而实现分离特点：方法简单、有效，成本较低，是常用的粗分离方法缺点：酸化时，目标产物比较容易失活生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化化学沉淀法原理：通过化学试剂与目的产物形成新的化合物，改变溶解度而沉淀特点：可针对性沉淀目的产物缺点：通用性差，需分解沉淀，回收目的产物生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化超滤和微滤原理：利用膜的筛分性质，以压差为传质推动力，膜具有明显的孔道结构特点：超滤适用于分离或浓缩直径1~50nm的生物大分子，微滤适用于细胞、细菌和微粒子的分离，目标物质的大小范围0.01~10

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缺点：膜易堵塞，膜需经常清洗、再生膜分离生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化透析原理：利用膜的筛分性质，以浓差为传质推动力特点：用于生物大分子的脱盐和复性缺点：样品处理量小电渗析原理：利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离特点：用于氨基酸和有机酸等生物小分子的分离纯化缺点：设备成本较高，操作较复杂，膜易堵塞，膜需经常清洗、再生生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化渗透汽化原理：利用溶质间透过膜的速度不同，以压差和温差为推动力特点：适合于乙醇和丁醇等挥发性发酵产物的分离缺点：设备成本较高，操作较复杂，膜易堵塞，膜需经常清洗、再生生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化离子交换层析原理：依据被分离物质各组分的电荷性质、数量以及与离子交换剂的吸附和交换能力不同而达到分离的目的特点：适用于带有电荷的大、中、小及生物活性或非生物活性物质的分离纯化，纯化效率较高，可柱式操作和搅拌式操作。应用广泛，常用于实验室和工业生产缺点：操作较复杂，试剂消耗量较大，成本高，放大比较困难，离子交换剂需再生后方可再用层析法生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化吸附层析法原理：依据范德华力、氢键等作用力将分离物吸附于吸附剂上，然后改变条件进行洗脱，达到分离纯化的目的特点：吸附色谱可柱式或搅拌式操作。吸附剂种类繁多，可选择范围和应用范围广，吸附和解吸的条件温和，不需要复杂的再生缺点：选择性较低，柱式操作放大困难生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化凝胶层析法原理：依据分子大小进行分离特点：分离条件温和，活性收率较高，选择性和分辨率高，应用广，适合于生物大分子的分离纯化缺点：放大较困难，稀释度高，操作不易掌握生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化疏水层析法原理：依靠疏水相互作用进行分离特点：选择性较好，使用稳定性好，应用较广缺点：成本较高，放大困难，需较严格控制条件，保证活性收率生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化亲和层析法原理：依据目的产物与专一性配基的专一性相互作用进行分离特点：选择性极高，纯化倍数和效率高，可从复杂的混合物中直接分离目的产物缺点：成本高，配基亲和稳定性差，使用寿命有限，亲和材料制备复杂，放大困难生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化结晶法原理：利用只有同类分子或离子才能排列成为晶体的性质进行分离特点：选择性好，成本低，设备简单，操作方便，广泛应用与抗生素等的分离缺点：要得到均匀的结晶时需要很高的操作要求，常常需要纯净的初始溶液、浓缩以及重结晶才能得到高品位的产物结晶法生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化2生物分离工艺介绍设计生物分离工艺流程时应从以下几个方面考虑：（1）产品的纯度和质量（2）分离方法的合理组合包括合理组合分离技术，设计合理的分离顺序及分离过程的衔接，进行各种分离技术的集成化（3）分离的成本考虑尽可能地降低成本，设法减少操作步骤并尽可能地增加每一步的收率，缩短周期生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化生物分离工艺的设计方法方法启发式：借鉴相同或相似产品的分离工艺来进行设计设计启发式：依据设计者的丰富经验，进行工艺设计的一种设计方法专家启发式：依据专家系统进行定性和定量分析后，通过检查、验证、移植进行分离工艺的设计数学模型式：依据分离纯化技术和生产过程中已建立的数学模型，对工艺进行检验和设计，仅适用于简单工艺的设计合成式：依据上述四种方法进行合成生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化分离工艺设计常采用的过程

生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化生物物质下游加工过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线1路线2细胞破碎碎片分离路线1A路线1B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化由于产物及杂质的种类不同，生化产品的分离纯化工艺也是不同的。但还是有一些共同点，总是将最容易分离的物质放在前面，而将难以分离的物质留在后面进行分离。第一步采用非特异性低分辨率的分离技术，如沉淀、粗吸附；第二步采用高分辨、较高选择性的分离技术；最后选择兼有高选择性分离纯化、澄清、脱盐等作用的分离技术。这种工艺安排是基于在粗分离时，物料体积较大，使用便宜、低选择性的技术来降低成本。而后面的步骤由于物料体积的减小和杂质的减少，就可以比较经济地使用更昂贵的高选择性分离步骤。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化3动物细胞培养的下游过程动物细胞培养是指动物细胞在体外条件下的存活和生长，此时细胞不再形成组织。应用：生产疫苗、单克隆抗体、免疫调节剂、酶和激素等。例如，中国仓鼠卵巢成纤维细胞（CHO细胞）以及叙利亚幼仓鼠肾肿瘤细胞（BHK细胞）广泛用于表达重组蛋白。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化3动物细胞培养的下游过程通常采用如下的工艺：培养液净化富集初步纯化精制产品。在动物细胞培养产物蛋白的分离纯化过程中，一旦条件合适，就应采用分离纯化效率最高的层析法进行蛋白的分离纯化。但具体如何选择，就要根据目标产物和准备处理的原料情况来确定。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化病毒的分离纯化在病毒的生产过程中，首先应考虑的因素是可得到的最大病毒浓度、在纯化过程中出现难分离的杂质以及潜在的致敏性等。病毒的分离纯化步骤为：培养液溶胞产物的澄清病毒悬浮液的浓缩浓缩液的纯化产品。病毒悬浮液的浓缩则可采用沉淀法、吸附-洗脱法、超滤法等来进行。病毒浓缩液的纯化可采用密度梯度离心、病毒亲和色谱、分子筛色谱等方法。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化基因工程产物的分离纯化工艺设计基因工程产物分离纯化工艺的设计特点：（1）产物的表达形式不同采取的设计策略不同（2）根据蛋白性质的不同选用不同的分离过程通常是根据产物分子的理化参数和生物学特性来进行蛋白质分离纯化方法的设计。生物化工反应单元操作——生物物质分离纯化蛋白特性与工艺设计的关系等电点决定离子交换的种类及条件。可以利用蛋白质离子交换层析分离等电点相同但表面电荷分布不同的两个蛋白质。对于等电点处于极端位置（pI＜5或pI＞8）的基因工程产物应首选离子交换层析，往往一步即可去除几乎所有的杂质。相对分子质量选择不同孔径及分级分离范围的介质。凝胶排阻层析就是根据蛋白质的相对分子质量和蛋白质分子的动力学体积的大小进行分离。疏水性决定与疏水、反相介质结合的程度。利用蛋白质的疏水性的差异来分离纯化的层析方法主要有疏水层析和反相层析。特殊反应性决定产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制。聚合性决定是否需要采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体。生物特异性决定亲和配基的选择。蛋白质的生物特异性可以帮助选择特异性的亲和配基，亲和分离由于其选择性强，在产物纯化中具有较大的潜力，但应注意选择亲和力适中而特异性较强的配基。溶解性决定分离体系及蛋白浓度。稳定性决定工艺采用的温度及流程操作时间等。蛋白特性及与工艺设计的关系