愈伤组织培养

关于愈伤组织培养愈伤组织概念：组织培养中，利用特定的条件，促使原已分化并具有一定功能的植物细胞脱离原来的发展轨道，失去原有的状态和功能而成为能进行活跃分裂的一团细胞，称为愈伤组织。愈伤组织的相关概念愈伤组织培养：将母体植株上的各个部分切下作为外值体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。第2页,共43页，2024年2月25日，星期天

第一节愈伤组织的诱导郁李的愈伤组织第3页,共43页，2024年2月25日，星期天再分化：愈伤组织在一定的培养条件下又可以经过胚胎发生形成双极性的胚状体，或经过器官发生形成单极性的芽或根，进而重新形成完整的植株，这后一段过程一般称为再分化。

脱分化：一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象。细胞的全能性的体现第4页,共43页，2024年2月25日，星期天一、愈伤组织形成的条件外植体（explant)培养条件(conditionofculture)诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。第5页,共43页，2024年2月25日，星期天1、外植体的选择一般情况下：双子叶植物比单子叶和裸子植物容易幼年细胞和组织比成年的容易二倍体细胞比单倍体细胞容易同一种植物不同基因型诱导愈伤组织的能力也不相同（24个水稻抗稻瘟病单基因鉴别品系悬浮细胞系的建立，14.3%~97.1%,周晓罡等，西南农业学报，2008年03期）第6页,共43页，2024年2月25日，星期天2、培养条件生长素：2,4-D、NAA、IAA等细胞分裂素：6-BA、KT、ZT等第7页,共43页，2024年2月25日，星期天二、愈伤组织的形成过程(王凯基等1981）图3-2油橄榄愈伤组织形成过程中各期细胞形态和RNA含量变化第8页,共43页，2024年2月25日，星期天（一）诱导期（起动期）诱导期又称起动期，指细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。第9页,共43页，2024年2月25日，星期天CallusarisingfromleaftissueCallusarisingfromvasculartissue

FromrootFromembryoculture第10页,共43页，2024年2月25日，星期天Photoindicatingwherethecallus(c)arisesfrom

第11页,共43页，2024年2月25日，星期天外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分裂，开始执行它们各自不同的功能。外植体细胞一般处于静止状态，称为静止细胞。第12页,共43页，2024年2月25日，星期天1、特点①细胞的气体交换迅速增加。②多聚核糖体不断增加：截止M期前，每个细胞中的RNA含量增加到300％；③蛋白质发生周期性的积累：每个分裂细胞的总增加量约为200％；④

酶活力也发生一定的变化：DNA聚合酶活力增加、与代谢有关的酶类，如己糖激酶和一些脱氢酶的活力也增加。⑤细胞的大小基本没有变化。第13页,共43页，2024年2月25日，星期天2、诱导期的长短内部：植物的种类、生理状况外部：光照、外源激素因素决定。最常用的有2，4－D、NAA、IAA和细胞分裂素等。组织的机械损伤也作为一种刺激因素诱导细胞开始分裂，愈伤组织往往出现在伤口处。有些天然提取物对愈伤组织的诱导和维持十分有益，常用的有椰子汁（10％），0.5％的酵母提取物，5％～10％的番茄汁。Yeoman和Mitchell(1970)指出了核仁是生长物质的作用部位。改善第14页,共43页，2024年2月25日，星期天（二）分裂期（Celldivision）外植体(explant)中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外植体外层细胞出现了分裂，由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小，逐渐回复到分生组织状态，因此也称为回复变化。第15页,共43页，2024年2月25日，星期天1、分裂期细胞的特征①外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。细胞的数目迅速增加。胡萝卜组织培养7d后，细胞数可增加10倍。②

每个细胞平均鲜重下降。③

细胞体积小，内无液泡。④核和核仁增大到最大。⑤RNA含量减少，而DNA含量保持不变。⑥随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。第16页,共43页，2024年2月25日，星期天细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。2、愈伤组织的特征第17页,共43页，2024年2月25日，星期天（三）分化期（Differentiation）停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。第18页,共43页，2024年2月25日，星期天分化结构的形成过程加速，超过了回复变化。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至停止，为次生生长所代替，大量次生结构出现。在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小往往没有变化。1、分化期特点第19页,共43页，2024年2月25日，星期天胡萝卜愈伤组织2、愈伤组织的特点生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。Friable松脆易碎的Hard/lignifiedcallus

第20页,共43页，2024年2月25日，星期天Callusmayhaveayellow,white,greenorred(anthocyanin花青苷)appearance.第21页,共43页，2024年2月25日，星期天第二节愈伤组织发生的形态学和细胞学

烟草愈伤组织在8周培养期间形态的变化（自桂耀林）第22页,共43页，2024年2月25日，星期天1、色泽：一般为淡黄色、绿色或白色，亦可为红色。影响因素：葡萄糖的水平，可溶性淀粉的存在，缺氮、温度、光及外源激素等营养物质和环境因素。黑暗中培养的烟草愈伤组织魔芋愈伤组织菠萝的愈伤组织一、形态学第23页,共43页，2024年2月25日，星期天Callusexudingstickypoly-saccharides

2、质地疏松致密Rhizogeniccallus

Friable松脆易碎的Hard/lignifiedcallus

Callustypes转换2,4-D（备注）有机态的还原态氮铵态氮细胞悬浮系第24页,共43页，2024年2月25日，星期天二、细胞学

图3-4图解示致密愈伤组织和疏松愈伤组织(A)致密愈伤组织(B)疏松愈伤组织

1.巨大的细胞2.管状细胞3.大的胞间隙愈伤组织并非完全由薄壁细胞组成。不同类型的愈伤组织在细胞组成上有明显不同。在长期培养过程中，愈伤组织细胞会发生染色体数目或结构的变化及基因突变：染色体出现多倍体和非整倍体组培快繁的障碍

育种提供基础第25页,共43页，2024年2月25日，星期天第三节愈伤组织培养中的形态发生及体细胞胚胎发生（一）细胞的分化（维管组织）（二）器官的分化一、愈伤组织培养中的形态发生二、体细胞胚胎发生第26页,共43页，2024年2月25日，星期天（一）细胞的分化1、在培养中，已观察到的细胞类型薄壁细胞分生细胞管胞色素细胞石细胞纤维细胞等，其中以维管组织（特别是木质部）的分化最为常见。第27页,共43页，2024年2月25日，星期天2、影响维管组织分化的主要因素激素生长素：起到主要的作用，低浓度刺激木质部分化。激动素：可以增加愈伤组织中管胞形成的比例；激动素和生长素协同增效作用BAP，2-iP和ZT也有一定的作用，但没有证据证明他们的普遍性。蔗糖在丁香的组织培养中，当生长素浓度不改变而变化蔗糖浓度时，在蔗糖浓度为1.5～2.5％的范围时，愈伤组织内仅形成木质部；超过4％时则几乎完全为韧皮部；在2.5～3.5％时，既形成木质部也形成韧皮部。物理因素：研究较少。光、温度对木质部的形成有一定的影响。第28页,共43页，2024年2月25日，星期天（二）器官分化1、通过器官发生途径产生再生植株的基本方式有3种（konar等，1972）芽根植株：普遍愈伤组织根芽植株：根有抑制芽产生的影响根和芽植株第29页,共43页，2024年2月25日，星期天2、影响因素激素2.4-D与KT：比例较高时，有利于茎的形成，反之，有利于根的形成。赤霉素（GA3）：抑制烟草、紫雪花（Plumbagoindica）秋海棠（Begonia）及水稻的器官分化。GA3的完全抑制作用只发生在黑暗条件下。乙烯：对芽的分化有一定作用，作用方向与植物种类和处理的时间有关。物理因素光强、光质和光周期：一般光强为1000～15001x，光周期12～16h，近紫外和蓝紫光促进芽的发生，而红光显著促进长根。温度：25℃左右的培养温度适于器官发生，但接近于植物原产地的生长温度对培养物更有利。

第30页,共43页，2024年2月25日，星期天（1）胚状体：高等植物的体细胞在一定条件下所诱导形成的胚，称为体细胞胚，即所谓的胚状体。二、体细胞胚胎的形成1.体细胞胚胎发生的几个概念（2）胚状体形成的5个阶段：

原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚和子叶期。第31页,共43页，2024年2月25日，星期天（3）由胚状体形成完整植株，与不定芽和根发生相比，有以下三个特征：

第一、具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端

分化芽端与根端，而不定芽或不定根都为单向极性;

第二、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联

系，而不定芽或不定根往往与愈伤组织的维管组织相联系；

第三、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y’形，而不定芽的维管

组织无此现象。第32页,共43页，2024年2月25日，星期天2、愈伤组织中胚状体特征①二极性

在组织培养的器官发生过程中，愈伤组织是一团无极性分化的细胞团，器官分化中芽或根分化只是具单极性，而胚状体在分化初期就具胚根和胚芽两极，具明显的形态特征上的极性（Polarity）类似于合子发育中的种子结构。②生理隔离（physiologicalisolation）：指体细胞胚与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间形成缝隙，处于较独立的状态，尽管细胞组织间仍有胞间连丝存在，这是体细胞胚获得营养，激素及能量来源的通道，其后这些细胞趋于解体。③遗传稳定胚状体起源于单细胞或细胞团，在其产生和发育过程中，一旦形成即通过了分化过程，结构即稳定无需较长时间的脱分化与再分化过程，细胞变异的频率较低，成苗率较高，遗传稳定性好。④重演受精卵形态发生的特征诱导阶段所形成的原胚或原胚团，要转入无激素的培养基中，使它进一步分化发育，经历球形胚，心形胚，鱼雷形及子叶形体胚的发育阶段。第33页,共43页，2024年2月25日，星期天3.愈伤组织中胚状体发生的部位可来自于外植体或愈伤组织表面的单细胞：较为常见可以发生在愈伤组织的内部。第34页,共43页，2024年2月25日，星期天4.体细胞胚胎发生的方式（1）由外植体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织阶段如石龙芮再生植株茎表面长出不定胚，槐树种子的子叶在组织培养过程中，可在切口处产生愈伤组织的同时，在子叶组织中分化出体细胞胚等。（2）外植体先愈伤化，然后由愈伤组织表面分化形成体细胞胚。第35页,共43页，2024年2月25日，星期天5.影响体细胞胚胎发生的主要因素（1）外植体不同植物的基因型不同，在培养条件下形成体细胞胚的反应各异。如柑橘类，胡萝卜及矮牵牛等容易诱导体细胞胚，但烟草却难以发生体细胞胚。柑橘类中的甜橙易于胚胎发生，而宽皮橘较难，各种植物种子的子叶一般易于发生胚状体。（2）生长调节物质：主要是生长素在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需的是一种含有生长素的培养基，通常所用的生长素是2,4-D，浓度范围0.5～1mg/L.=====胚性细胞团----继代培养不能形成胚。再转入生长素含量极低或没有的培养基上====胚第36页,共43页，2024年2月25日，星期天（3）氮源

无机态的NH4+有利于胚胎发生。有机态的氮：椰乳，酵母提取液、水解酪蛋白，其使用的浓度多在400mg/L左右。（4）其他因子据Brown等（1976）报道，在野生胡萝卜中，高浓度的钾（20mmol/L）是胚胎发生所必需的。在培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值（1.5mg/L）,否则将有利于生根，而不利于成胚。另外，培养过程中的环境条件如光照，温度，对外植体的预处理如辐射，低温及离的等都会影响胚状体的发生。第37页,共43页，2024年2月25日，星期天三、人工种子（artifici