原生质体培养和体细胞杂交

关于原生质体培养和体细胞杂交(1)了解原生质体培养的意义；(2)掌握原生质体分离的大致步骤；

(3)掌握原生质体培养的方法；(4)掌握原生质体融合的方凑。第7章原生质体培养与和体细胞杂交本章教学目的与要求第2页,共41页，2024年2月25日，星期天

原生质体（Protoplast）含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。第7章原生质体培养与和体细胞杂交第3页,共41页，2024年2月25日，星期天微丝叶绿体线粒体质膜细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图第7章原生质体培养与和体细胞杂交液泡第4页,共41页，2024年2月25日，星期天第一节、原生质体分离及纯化一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞第7章原生质体培养与和体细胞杂交第5页,共41页，2024年2月25日，星期天多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。第一节、原生质体分离及纯化（一）材料来源禾本科植物：愈伤组织或悬浮细胞。第6页,共41页，2024年2月25日，星期天第一节、原生质体分离及纯化（二）分离方法机械分离法酶法分离法第7页,共41页，2024年2月25日，星期天1、机械分离法（Machanicalisolation）第一节、原生质体分离及纯化优点：

（1）能排除酶的有害影响；

缺点：

（1）原生质体的产量低；

（2）方法繁琐费力；

（3）局限性大第8页,共41页，2024年2月25日，星期天（1）酶的种类纤维素酶类（Cellulase）果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）崩溃酶蜗牛酶2、酶法分离（Enzymaticisolation）第一节、原生质体分离及纯化第9页,共41页，2024年2月25日，星期天（2）酶液的配制第一节、原生质体分离及纯化渗透压稳定剂及pH酶的配比及浓度第10页,共41页，2024年2月25日，星期天（3）分离原生质体第一节、原生质体分离及纯化两步分离法一步分离法方法有二：叶肉原生质体分离提纯第11页,共41页，2024年2月25日，星期天图示原生质体分离过程（以叶片为例）第一节、原生质体分离及纯化过滤、离心加果胶酶和纤维素酶第12页,共41页，2024年2月25日，星期天第一节、原生质体分离及纯化叶片愈伤组织第13页,共41页，2024年2月25日，星期天二、原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化第一节、原生质体分离及纯化方法三种离心沉淀法漂浮法界面法第14页,共41页，2024年2月25日，星期天1、离心沉淀法原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。第一节、原生质体分离及纯化第15页,共41页，2024年2月25日，星期天2、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。步骤：第一步：400目网筛过滤。第二步：离心。第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。第一节、原生质体分离及纯化第16页,共41页，2024年2月25日，星期天3、界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。第一节、原生质体分离及纯化第17页,共41页，2024年2月25日，星期天（二）原生质体活力测定1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。第一节、原生质体分离及纯化第18页,共41页，2024年2月25日，星期天第二节原生质体培养一、培养基pH渗透压钙镁生长物质氮源碳源培养基第7章原生质体培养与和体细胞杂交第19页,共41页，2024年2月25日，星期天二、培养方法培养方法液体浅层培养平板培养法双层培养法饲养层培养法第二节、原生质体培养第20页,共41页，2024年2月25日，星期天1、液体浅层培养第二节、原生质体培养原生质体悬浮液1mm厚液体培养基2x105/ml第21页,共41页，2024年2月25日，星期天2、平板培养

原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37

C左右）等体积混合成0.7%，培养于培养皿中。第二节、原生质体培养第22页,共41页，2024年2月25日，星期天3、双层培养法（固、液培养）

培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。第二节、原生质体培养第23页,共41页，2024年2月25日，星期天4、饲养层培养方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。第二节、原生质体培养第24页,共41页，2024年2月25日，星期天方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。4、饲养层培养第二节、原生质体培养第25页,共41页，2024年2月25日，星期天定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。第7章原生质体培养与和体细胞杂交第三节、原生质体融合第26页,共41页，2024年2月25日，星期天一、原生质体融合意义—克服杂交不亲合—克服生殖器官败育—克服柑桔多胚第三节、原生质体融合第27页,共41页，2024年2月25日，星期天二、融合方法

无机盐诱导融合高pH-高Ca离子聚乙二醇(PEG)法

PEG结合高钙-高pH诱导法电融合技术第三节、原生质体融合第28页,共41页，2024年2月25日，星期天(一)无机盐诱导融合:

NaNO3法1972年：Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。第三节、原生质体融合第29页,共41页，2024年2月25日，星期天

1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。第三节、原生质体融合（二）高pH-高Ca离子法第30页,共41页，2024年2月25日，星期天PEG法特点：融合频率高可重复性强诱发融合无特异性毒性较低植物+植物植物+动物动物+酵母第三节、原生质体融合（三）PEG法第31页,共41页，2024年2月25日，星期天PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。第三节、原生质体融合第32页,共41页，2024年2月25日，星期天最为常用。具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞第三节、原生质体融合（四）PEG结合高钙-高pH诱导法第33页,共41页，2024年2月25日，星期天(五)电融合技术Senda1979年首先用此方法实现原生质体融合第三节、原生质体融合第34页,共41页，2024年2月25日，星期天三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1．互补选择法第三节、原生质体融合2、机械分离杂种细胞法3.双荧光标记选择法第35页,共41页，2024年2月25日，星期天异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色3.双荧光标记选择法第三节、原生质体融合第36页,共41页，2024年2月25日，星期天四、体细胞杂种植株的鉴定

形态学鉴定细胞学观察

DNA内切图谱分析同工酶分析第三节、原生质体融合第37页,共41页，2024年2月25日，星期天(1)原生质体培养的意义：(1)再生植株；(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。(2)原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。(3)酶的种类及特点(4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。(5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。第7章原生质体培养与和体细胞杂交本章小结：第38页,共41页，2024年2月25日，星期天（6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养（7）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。（8）杂种细胞的筛选与鉴