黄曲霉毒素的检测及防控课件

黄曲霉毒素的检测及防控AnalysisandControlofAflatoxins内容黄曲霉毒素的概述黄曲霉毒素的国际限量要求黄曲霉毒素的检测黄曲霉毒素污染的预防和控制山东局技术中心黄曲霉毒素实验室输欧花生黄曲霉毒素实验室检测一、黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素的研究历史黄曲霉毒素的毒理作用黄曲霉毒素的产生黄曲霉毒素的分布黄曲霉毒素的化学性质研究历史1960年,英国10万只火鸡死亡事件揭开了人们对于黄曲霉毒素的认识与研究。火鸡的死亡与饲料中含有较高浓度的黄曲霉毒素有关。用这种饲料（花生粉）对动物进行急性毒理实验后，证明具有强毒性。对大白鼠进行长期的慢性中毒实验后，成功地诱发了肝癌。对毒饲料进行提取，得到了黄曲霉毒素。在随后的几十年中，黄曲霉毒素得到了科学界的高度重视。黄曲霉毒素的毒理作用黄曲霉毒素是潜在的肝脏毒素。当大剂量摄入这些毒素时可能是致命的。亚致死剂量会导致慢性中毒，而低剂量的长期接触则会致癌，特别是导致肝癌。通常，动物幼仔比成年动物更加容易遭受黄曲霉毒素的毒害。黄曲霉毒素引起了人们对健康最强烈的关注，是因为其广泛分布于一些食物诸如花生、坚果、牛奶、玉米中，同时也是人类潜在的致癌原。黄曲霉毒素的产生黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生曲霉等在代谢过程中产生。黄曲霉毒素产生的条件：菌株的产毒能力、适宜的湿度（80%-90%相对湿度和基质的含水量）、温度（24-30度）、氧气（1%以上）、培养时间、机械损伤、昆虫损害等。黄曲霉毒素的分布黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2大多分布在农产品中，常见的有花生、玉米、棉籽、芝麻、杏仁、辣椒等。黄曲霉毒素M1分布在牛奶及奶制品中。在哺乳动物的肝脏与尿中发现了黄曲霉毒素P1和Q1。黄曲霉毒素的化学性质黄曲霉毒素是结果相近的一群衍生物。化学结构式为二呋喃环和香豆素。在紫外线下，黄曲霉毒素B1、B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉毒素的分解温度为237-299度，一般加热不能破坏其毒性。在有氧条件下，紫外线照射可去毒。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在强碱溶液下易分解黄曲霉毒素B1同肝细胞DNA的鸟嘌呤碱基结合，使得控制细胞生长的基因代码发生错误，从而使细胞生长失控，成为癌性肿瘤。

二、黄曲霉毒素的国际限量

Codex花生(未加工):黄曲霉毒素总量15ppb

牛奶:黄曲霉毒素M10.5ppbEU黄曲霉毒素B1/总量花生、坚果、干果：2/4ppb花生（进一步挑选等）：8/15ppb坚果、干果（进一步挑选）：5/10ppb谷物及加工产品：2/4ppb各种调味品：5/10ppb澳大利亚、新西兰黄曲霉毒素总量：花生：15ppb美国所有食品：黄曲霉毒素总量20ppb黄曲霉毒素的中国限量玉米、花生、花生油、坚果等B1不得超过20ppb。大米、其他食用油等B1不得超过10ppb。其它粮食（麦类、面粉、薯干）、发酵食品（酱油、醋等）、淀粉类制品（糕点、饼干、面包等）B1不得超过5ppb。牛奶及其制品中M1不得超过0.5ppb。三、黄曲霉毒素的检测黄曲霉毒素的检测，从广义上，包括：采样、制样和检测三个过程。黄曲霉毒素的检测一直是困扰世界各国的难题。原因：不均匀分布；ppb水平检测程序analyticalprocedure采样样品制备/分样分析检测采样sampling目的：得到一个有代表性的样品困难：1）分布不均匀

2）ppb水平办法：尽量加大采样点和采样量，使货物的每个部位都有同等的机会被抽到。均匀分布（如蛋白质）不均匀分布（黄曲霉毒素）

所谓“ppb”1，000，000，000中的1分子

32年中的1秒地球至月球总距离中的40cm22公斤沙子中的1粒

3.5车厢中的1粒玉米

检测误差

ErrorsinAnalysis集装箱样品小样检测100%总误差88%采样误差10%制样误差2%检测误差WhitakerDicken，1974针对卡车或拖车装载玉米的取样方式:第一次取样的位点标记为“O”.如果需要更多的样品，应在标记为“X”的位点再次取样取样方式从卡车中的取样量由于分布不均匀可能检测到的结果范围4.50kg2.25kg1.00kg0.45kg11.6-28.4ppb8.1-31.9ppb3.2-38.8ppb0-46.9ppb*95%confidencerange一卡车玉米中有20ppb黄曲霉毒素的污染样品制备samplepreparation目的：将样品充分粉碎、均质化，为下一步检测做准备办法：使用高效粉碎机，粉碎最终直径小于2mm制样误差约占总误差的10%分析检测test提取extraction净化purification分析analysis分析程序-提取使用甲醇/水或乙腈/水混合液萃取研磨样品使用搅拌机(2-5Minutes)或震荡仪(30-180Minutes)震荡萃取液.样品液数量与溶剂数量存在最佳比例。注意所使用的有毒溶剂对健康的损害及污染分析程序----净化净化是指去除提取液中的杂质（如脂肪、蛋白质、色素等），以避免对黄曲霉毒素的检测造成干扰。几种常用的净化方法免疫亲和柱(IAC)净化固相萃取柱（SPE）净化液-液萃取其他黄曲霉毒素的分析方法快速筛选法：荧光光度计法

ELISA法确证方法：

HPLC-FLD法免疫亲和柱净化-荧光光度计法原理：紫外线照射后，黄曲霉毒素能发射特征荧光优点：1、操作简便、安全2、检测限小于2ppb缺点：有假阳性的存在酶联免疫法原理：利用抗原抗体反应并由酶催化底物产生颜色进行定量的分析方法优点：1、操作简便、成本较低

2、有些商品化的试剂盒检测限能达到1ppb

缺点：有假阳性的存在方法的选用经过筛选方法检测的样品，可以继续通过基准方法进一步确证黄曲霉毒素的存在，并进行更加准确的定量检测。四、黄曲霉毒素的预防与控制预防prevention采样sampling样品制备samplepreparation样品提取extraction测试需求评价evaluationoftestingrequirements检测testing结果确证resultvalidation文本化documentation供货方介入supplierinvolvement去毒removal五、山东局技术中心生物毒素实验室介绍

1.AprofessionalMycotoxin

laboratory.

一个专业化的官方实验室

2.AlonghistorytodetectAflatoxin.

检测黄曲霉毒素历史悠久

Introduction悠久的历史Usebiologymethodsince1970s.UseTLCmethodsince1980s.UseHPLCmethodsince1990sHPLC-MS/MSCerealsMulti-mycotoxinBio-method/ELISASeafoodsDSP/PSPHPLC-FLD/ELISACerealsT-2toxinHPLC-FLDCorn,cerealsZearalenoneHPLC-UVCerealsDeoxynivalenolHPLC-UVApplejuicePatulinHPLC-FLDMilk,milkpowderAflatoxinM1IAC/PCD/HPLC-FLDPeanut,corn,cerealsAflatoxinMethodCommodityParameter

生物毒素检测业务&

实验室认可STCIQisaccreditedbyChinanationalaccreditationserviceforConformityAssessment(CNAS)andoperatedinaccordancewithISO/IEC17025:2005(E)Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories.FAPAS成绩时间Date轮次号FAPASSeriesandRoundAFB1z-scoreTotalAFz-score2001.11Series4Round39-0.5-0.22002.10Series4Round470.70.72003.7Series4Round56-0.7-0.52004.9Series4Round67-0.4-0.42005.8FAPAS04790.80.92006.4FAPAS04880.80.82007.7FAPAS0410400组织国内能力验证活动1时间:2002年Analyse:花生酱中的黄曲霉毒素组织者:CCIBLAC轮次:国认实函[2001]17号参加实验室数:63

组织国内能力验证活动2时间:2005Analyse:花生酱中的黄曲霉毒素组织者:国家食品安全局Round:质检食函[2005]082号参加实验室数:15

组织国内能力验证活动3日期:2005Analyse:Aflatoxin

AnalysisinPeanutpaste组织者:山东局Round:鲁检便食字第077号AttendedLaboratoryNumber:52

组织国内能力验证活动4Date:2006(ongoing)Analyse:Aflatoxin

AnalysisinPeanutpasteSponsor:CNASRound:CANST0339AttendedLaboratoryNumber:74

组织国内能力验证活动5Date:2006Analyse:AflatoxinAnalysisinPeanutpasteSponsor:山东局Round:AttendedLaboratoryNumber:89六输欧花生黄曲霉毒素的实验室检测工作&

（黄曲霉毒素的检测流程）FlowchartofAflatoxinanalysis接样Samplereceive

样品登记Sampleregister

样品制备Samplepreparation

净化Samplecleanup

测定SampleHPLCdetermination

报告Report

留样、记录Reservesamplesandrecords接样(1)Isitsealed?Isitclearlylabelled?Isitweighabout30kg?Samplereceive(2)样品登记分样SamplesmustbeThoroughlymixedbeforedividedintothreeSub-samples样品制备、样品均匀性测试

Sample

preparation

实验室样品、留存样品

Samplepreparationrecord实验室前处理SampleClean-up仪器测定HPLC

Determination如何保证检测结果的准确？

实验室质量控制1、样品制备过程：定期进行样品均匀性核查2、实验室检测过程：日常检测采用加标回收和质控样品加标回收质控样品3、每年参加国际间实验室能力验证活动检测报告的格式与解释1、方法的检出限（LOD）

2、方法的检测限（LOQ）

3、回收率（Recovery）

4、不确定度（Uncertainty）

报告中的检出限、检测限针对GB/