生物信息的传递从到全

关于生物信息的传递从到全（上）从DNA到RNA基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。第2页,共138页，2024年2月25日，星期天基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。第3页,共138页，2024年2月25日，星期天FrancoisJacob(Left),JacquesMonod(Center)&AndreLwoff(Right)第4页,共138页，2024年2月25日，星期天DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。与mRNA序列相同的那条DNA链是编码链（codingstrand）或称有意义连（sensestrand）；另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链则被称为模板链（templatestrand）或称反义链（antisensestrand）。第5页,共138页，2024年2月25日，星期天DNA和RNA虽然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂，它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。因为只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。

DNA模板与mRNA分子及多肽链之间存在共线性关系第6页,共138页，2024年2月25日，星期天生物体内拥有三类RNA，即：编码特定蛋白质序列的mRNA；能特异性解读mRNA中的遗传信息并将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的tRNA；直接参与核糖体中蛋白质合成的rRNA。第7页,共138页，2024年2月25日，星期天3.1RNA的转录3.1.1转录的基本过程

无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：

模板识别转录起始通过启动子转录的延伸和终止第8页,共138页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌中依赖于DNA的RNA转录过程图示转录泡中单链DNA的长度约在17bp左右，被聚合酶复合物所保护的DNA序列约为35bp左右第9页,共138页，2024年2月25日，星期天模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物（preinitiationtranscriptioncomplex,PIC），以保证有效地起始转录。第10页,共138页，2024年2月25日，星期天转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。第11页,共138页，2024年2月25日，星期天3.1.2转录机器的主要成分1.RNA聚合酶RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶，主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2+/Mn2+为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA。第12页,共138页，2024年2月25日，星期天大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β'亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65×105。大肠杆菌RNA聚合酶第13页,共138页，2024年2月25日，星期天第14页,共138页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析第15页,共138页，2024年2月25日，星期天α亚基可能与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰，造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力降低。由β和β'亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。第16页,共138页，2024年2月25日，星期天σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。核心酶在T7噬菌体DNA上约有1300个结合位点，平均结合常数为2×1011。σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的半衰期小于1秒。第17页,共138页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌中的σ因子能识别并与启动子区的特异性序列相结合在大肠杆菌中，最常见的调控因子是由rpoD基因所编码的σ70。由rpoH编码的σ32是与热休克启动子所控制的基因转录密切相关。由rpoN编码的σ54则参与细胞的氮代谢。第18页,共138页，2024年2月25日，星期天真核生物RNA聚合酶的主要特征：聚合酶中有两个相对分子质量超过1×105的大亚基；同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中3类或2类聚合酶所共有的。真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同，对α-鹅膏覃碱的敏感性也不同。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。第19页,共138页，2024年2月25日，星期天真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较第20页,共138页，2024年2月25日，星期天2.转录复合物启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closedcomplex），此时，DNA仍处于双链状态。然后，封闭复合物转变成开放复合物（opencomplex），聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开。对于强启动子来说，从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的，是快反应。第21页,共138页，2024年2月25日，星期天开放复合物与最初的两个NTP相结合并在这两个核苷酸之间形成磷酸二酯键后即转变成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元复合物(ternarycomplex)。RNA合成的起始第22页,共138页，2024年2月25日，星期天真核生物RNA聚合酶II所形成的转录起始复合物除RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与第23页,共138页，2024年2月25日，星期天转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。第24页,共138页，2024年2月25日，星期天一般情况下，转录起始复合物可以进入两条不同的反应途径：一是合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物，即所谓的流产式起始；二是尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。转录延伸复合物较为稳定，可长时间与DNA模板结合而不解离。只有在遇到转录终止信号时，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA杂合物解离，释放转录产物并导致聚合酶本身从模板DNA上脱落。第25页,共138页，2024年2月25日，星期天3.2启动子与转录起始大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及σ因子的结合与解离。第26页,共138页，2024年2月25日，星期天3.2.1启动子区的基本结构启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。第27页,共138页，2024年2月25日，星期天转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤。把起点5‘末端的序列称为上游（upstream），而把其3'末端的序列称为下游（downstream）。起点为+1，下游方向依次为+2、+3……等，上游方向依次为–1、–2、–3……等等。第28页,共138页，2024年2月25日，星期天第29页,共138页，2024年2月25日，星期天转录单元（transcriptionunit）是一段从启动子开始至终止子（terminator）结束的DNA序列。第30页,共138页，2024年2月25日，星期天Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNaseI水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段转录启动子区DNA序列的分离纯化过程启动子区有什么结构特点呢？第31页,共138页，2024年2月25日，星期天启动子区有什么结构特点呢？Pribnow将RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNaseI降解DNA，得到41～44个核苷酸对的DNA片段。序列分析发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的保守序列，是聚合酶结合位点，称为Pribnow区，其中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。第32页,共138页，2024年2月25日，星期天科学家又从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SV40启动子的–35bp附近找到了另一段共同序列：TTGACA。现已证实大部分启动子都存在这两段共同序列，即于–10bp处的TATA区和–35bp处的TTGACA区，它们是RNA聚合酶与启动子的结合位点。

–35区–10区

……T85T83G81A61C69A52……T89A89T50A65A100……第33页,共138页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区第34页,共138页，2024年2月25日，星期天在真核生物基因中，Hogness等发现类似Pribnow区的Hogness区，在转录起始点上游-25～-30bp处，保守序列为TATAAA，也称TATA区。在起始位点上游-70～-78bp处还有另一段共同序列CCAAT，称为CAAT区（CAATbox）。第35页,共138页，2024年2月25日，星期天真核生物RNA聚合酶II所识别的启动子区第36页,共138页，2024年2月25日，星期天RNA合成的基本特点:1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶（RNAPol）。其特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物；（2）以DNA为模板；（3）按5'-3'方向合成；（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；（7）RNA的序列和模板是互补的。第37页,共138页，2024年2月25日，星期天现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链（antisenstrand），非模板链称为有义链（sensestrand）或编码链。在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。第38页,共138页，2024年2月25日，星期天RNA合成和DNA复制的区别（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板；（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母链形成子链；（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物；（4)转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；（5）聚合酶系不同。第39页,共138页，2024年2月25日，星期天RNA聚合酶(RNApol)和DNApol有2点不同：（1）RNApol没有任何校对功能；（2）能起始新的RNA链。

第40页,共138页，2024年2月25日，星期天RNApol

执行多功能(1)识别DNA双链上的启动子；(2)使DNA变性在启动子处解旋成单链；(3)通过阅读启动子序列，RNApol确定它自己的转录方向和模板链。(4)最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。第41页,共138页，2024年2月25日，星期天启动子（promoter）的结构特点

(1)结构典型,都含识别(R),结合(B)和起始(I)位点;(2)序列保守;(3)位置和距离都比较恒定；

(4)直接和多聚酶相结合；

(5)常和操纵子相邻；

(6)位于基因的5'端；

(7)决定转录的启动和方向。

(8)特殊的操纵子的R,B序列不同。第42页,共138页，2024年2月25日，星期天典型启动子的结构

-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp现已证实大部分启动子都存在这两段共同序列，即位于–10bp处的TATA区和–35bp处的TTGACA区，它们是RNA聚合酶与启动子的结合位点。第43页,共138页，2024年2月25日，星期天1.-10序列：-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnowbox）。保守序列为TATAAT位于-10bp左右，A.T较丰富，易于解链。其功能是：

(1)RNApol紧密结合;(2)形成开放启动复合体；

(3)使RNApol定向转录。第44页,共138页，2024年2月25日，星期天-10序列对转录的效率影响TATAAT→AATAAT，转录效率下降,称为下降突变（downmutation）。TATGTT→TATATT，转录效率上升，为上升突变（upmutation）。以上突变为何会影响转录效率？前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆积能，后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少第45页,共138页，2024年2月25日，星期天2.-35序列-35序列又称为Sextama盒（Sextamabox），其保守序列为（TTGACA）其功能是:(1)为RNApol的识别位点。

σ亚基识别-35序列，为转录选择模板(2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNApol的结构有关。第46页,共138页，2024年2月25日，星期天3.转录起始位点（I）转录开始时模板上的第一个碱基在原核中常为A或G而且位置固定第47页,共138页，2024年2月25日，星期天转录的起始1.全酶与模板的DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；2.起始识别：全酶与－35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closedbinarycomplex）；3.全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；4.酶移动到I，第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternarycomplex）。第48页,共138页，2024年2月25日，星期天RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:(1)σ和1/3的RNApol结合成全酶，或在非特异位点的松散复合体中，或在启动子中的二元复合体中；(2)其中半数的核心酶从事转录；(3)余下的核心酶大量存在于闭合松散复合体中；(4)估计数量很少的全酶是游离的。第49页,共138页，2024年2月25日，星期天RNAPol启始基因转录后，就沿模板不停地移动，合成RNA链直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生RNA链。所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都被破坏，模板DNA链与非模板链重新组合成DNA双链。原核生物转录的终止第50页,共138页，2024年2月25日，星期天终止子（terminator,t）

强终止子－内在终止子（intrinsicterminators）。又称为不依赖于ρ因子的终止

弱终止子－需要ρ因子（rhofactor）。又称为ρ依赖性终止子（Rho-dependentterminator）第51页,共138页，2024年2月25日，星期天强终止子的结构…NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNN……NNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNN…DNA…NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNN…RNA第52页,共138页，2024年2月25日，星期天NNN

NNG·CC·GC·GG·CC·GG·CC·U…NNNNC·UUUUU…-OH3’

强终止子结构的模式图

强终止子的结构特点（1）有回文结构存在；（2）茎的区域内富含G-C；（3）强终止子3′端上有6个U；

以上结构特点在终止中起何作用？第53页,共138页，2024年2月25日，星期天

新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5’端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3’端部分出现不稳定的rU•dA区域，两者共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构（至少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐步提高。第54页,共138页，2024年2月25日，星期天依赖于ρ因子的终止提纯的RNA聚合酶并不能识别特异性的转录终止信号，而加入大肠杆菌ρ因子后该聚合酶就能在DNA模板上准确地终止转录。ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离。第55页,共138页，2024年2月25日，星期天第56页,共138页，2024年2月25日，星期天

RNAPol转录DNAρ因子附着到RNA

识别位点上ρ因子跟在RNAPol后沿RNA移动RNAPol在终止位点停下，并被ρ因子追上在转录泡中ρ因子使DNA-RNA杂种双链解开转录终止,释放出RNAPol,ρ因子和RNA第57页,共138页，2024年2月25日，星期天

真核生物的转录真核生物的转录和原核转录的不同点：(1)原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶；(2)启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和有关的元件；(3)真核的转录有很多蛋白质因子的介入。第58页,共138页，2024年2月25日，星期天一.真核的RNA聚合酶

表12-2真核生物的三种RNA聚合酶的特点 RNAPol 位置 产物 相对活性对α-鹅膏蕈的敏 PolⅠ 核仁 28s,18s,5.8srRNAs50～70%不敏感 PolⅡ 核质 hnRNA,mRNA,某些SnRNA20～40% 高度敏感 PolⅢ 核质 tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs～10%片段特异，中等敏感

表12-3转录的抑制剂 抑制剂 靶酶 抑制作用 利福霉素 细菌全酶 和β亚基结合，抑制起始 链霉溶菌素 细菌核心酶 和β亚基结合，抑制起始 放射线素D 真核PolⅠ 和DNA结合，阻止延伸

α-鹅膏蕈 真核PolⅡ 和RNAPolⅡ结合

第59页,共138页，2024年2月25日，星期天

B220～240Kda—与模板结合，与链的起始，延伸有关，相当于原核RNAPol的β′亚基C端含有羧基末端功能区 大亚基B140～150Kda—与DNA、底物和新生的RNA结合,相当于原核RNAPolβ

B44.5—酶的连接，相当于原核RNA的α亚基 RNAPolⅡ ABC27KDa磷酸化蛋白，

1类—三种RNAPol共有，如ABC25.5KDa与DNA结合有关

ABC23KDa B12.6

小亚基2类—PolⅡ特有B23 B14.5 B10 3类—在某些条件下可除去的亚基 B23 参与酶的基本结构

B16.5 细胞器的RNAPol—和噬菌体的RNA相似，因有单一固定的功能，分子量较小 表12-3真核生物聚合酶的成分及功能 第60页,共138页，2024年2月25日，星期天二．真核生物的启动子

启动子Ⅱ最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用（6）不直接和RNApol结合；（7）需多种转录因子介入。第61页,共138页，2024年2月25日，星期天

真核启动子含有不同的组件SV40早期启动子胸苷激酶组蛋白H2B

-140-120-100-80-60-40-20+1

OctCAATGCTATA第62页,共138页，2024年2月25日，星期天(一)Ⅱ类基因的启动子和调控区

TATA框核心元件启始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5构成，

位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ识别。

CAATbox、Ⅱ类启动子上游元件组成GCboxOct．增强子（enhomcer）远端调控区减弱子（dehancer）静息子（sisencer）上游激活序列（upstreamactivatingseguences，UASs）

第63页,共138页，2024年2月25日，星期天起始子起始点一般没有同源序列mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py组成称为起始子（initiator,Inr).（在原核CAT起始序列也有这种情况）。一般由PY2CAPY5构成位于-3～+5提供RNApolⅡ识别。无论TATA是否存在，Inr对启动子的强度和起始位点的选择都是重要的。现已纯化了Inr结合蛋白。第64页,共138页，2024年2月25日，星期天核心元件

TATA框又称Hogness框，Goldberg-Hogness

框，俚语称为金砖（Goldbrick）其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50常在-25左右，相当于原核的-10序列。其作用是：

(1)选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector）。

(2)影响转录的速率。第65页,共138页，2024年2月25日，星期天上游启动子元件（UPE）

表12-4哺乳动物RNAPolⅡ上游转录因子结合的元件

元件 保守序列 结合DNA的长度蛋白质因子TATAbox TATAAAA ～10bp TBP CAATbox GGCCAATCT ～22bp CTF/NF1GCbox GGGCGG ～20bp SP1 Octamer ATTTGCAT ～20bp Oct-1Octamer ATTTGCAT 23bp Oct-2KB GGGACTTTCC ～10bp NFKB ATF GTGACGT ～20bp ATF B.Lewin:《GENES》Ⅵ.1997,Table28.2第66页,共138页，2024年2月25日，星期天增强子或强化子（enhancer）已在SV40的转录单元上发现其转录起始位点上游约200bp处有两段72bp长的重复序列，它们不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这两段序列会大大降低这些基因的转录水平，若保留其中一段或将之取出插至DNA分子的任何部位，就能保持基因的正常转录。因此，称这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子（enhancer）。第67页,共138页，2024年2月25日，星期天增强子它是在1981年由Benerji,Rusconi小组和Chambom等发现的,又称远上游序列（farupstreamseguence）其特点是：①具有远距离效应。②无方向性。无论位于靶基因的上游、下游或内部都可发挥增强转录的作用。③顺式调节。只调节位于同一染色体上的靶基因，而对其他染色体上的基因没有作用。④无物种和基因的特异性。可以连接到异源基因上发挥作用。⑤具有组织的特异性。增强子只有与特定蛋白质相互作用才能发挥功能。⑥有相位性。其作用和DNA的构象有关。⑦有的增强子可以对外部信号产生反应。第68页,共138页，2024年2月25日，星期天第69页,共138页，2024年2月25日，星期天增强子为什么具有远距离作用呢？（1）拓朴效应；拓朴效应说认为增强子的作用是诱导染色质结构变化，使核小体产生DNaseI敏感区。（2）滑动模型；（3）成环模型。Enhancer

Promotor第70页,共138页，2024年2月25日，星期天

表12-5人类Ⅱ型启动子的转录因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ≥10K 依赖模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基

TFⅡB 33K 结合模板链（-10～+10），起始PolⅡ结合，和TFⅡE/F相互作用 TFⅡD (TBP,30K)TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子 TFⅡE 34K(β)结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游

57K(α)TFⅡF 38,74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和PolⅡ结合，介导其加入复合体 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸 TFⅡI 120K 识别Inr，起始TFⅡF/D结合 TFⅡJ 在TFⅡF后加入复合体，不改变DNA的结合方式 TFⅡS RNA合成延伸 第71页,共138页，2024年2月25日，星期天

转录因子转录复合体TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的转录起始结合在PolⅡ的前部，使复合体的保护区延伸到下游小亚基和PolⅡ结合，介导其加入复合体稳定TFⅡD和DNA的结合，激活TBP亚基TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别特殊启动子起始PolⅡ结合第72页,共138页，2024年2月25日，星期天(三)RNApolⅠ启动子核心启动子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于-45到+20，负责转录的起始。上游控制元件（upstreamcontrolelementUCE），从-180延伸到-107，可增加核心元件的转录起始的效率。第73页,共138页，2024年2月25日，星期天－170－160－150－140－130－120－110………－60－－50－40－30－20－101＋10＋20

上游控制区核心启动子

UBF1UBF1结合于G－C丰富区

SL1SL1与UBF1协同结合TFⅡB

Pol1

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第74页,共138页，2024年2月25日，星期天RNApolⅢ启动子的转录因子的结构和功能因子 结构 功能 TFⅢA38Kda,有9个锌指结合于1型内部启动子(5sRNA基因)的C框

使ⅢC结合在C框下游，辅助ⅢB定位结合TFⅢB含TBP和另外二种蛋白 定位因子，使Pol结合在起始位点上 TFⅢC含τA和τB,有5个亚基τB结合Ⅱ型内部启动子(tRNA基因)的B框起增强子的作用。τA结合A框，起启动子的作用；辅助ⅢB定位结合 TBP 是ⅢB,ⅡD,SL1的亚基 和特异DNA序列及RNAPol结合，使Pol结合在正确的位点上 TFⅡD 含TBP亚基 结合TATA框，确定选择PolⅢ PBP 次近端结合蛋白 可能和ⅡD一道辅助ⅢB定位结合的另一途径 第75页,共138页，2024年2月25日，星期天

TBPPolIII启动子

TFIIIB使ⅢC结合在C框下游，辅助ⅢB定位结合定位因子，使Pol结合在起始位点上

TBPRNAPolIII

PolI启动子

SL1RNAPolI

TBPUBF1PolII启动子

TFIIDTATA转录起始点RNAPolII

和特异DNA序列及RNAPol结合，使Pol结合在正确的位点上结合TATA框，确定选择PolⅢ第76页,共138页，2024年2月25日，星期天3.3原核与真核生物mRNA的特征比较mRNA在大肠杆菌细胞内占总RNA的2%左右，tRNA占16%，rRNA则占80%以上。真核细胞的mRNA往往以较大相对分子量的前体RNA出现在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经化学修饰的mRNA才能进入细胞质，参与蛋白质的合成。所以，真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。第77页,共138页，2024年2月25日，星期天3.3.1原核生物mRNA的特征1.半衰期短。

原核生物中，mRNA的转录和翻译是在同一个细胞空间里同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。大多数细菌mRNA在转录开始1分钟后就开始降解。mRNA降解的速度大概是转录或翻译速度的一半。科学家发现每过大约2分钟，体系中出现新生蛋白质的速度就下降50%。第78页,共138页，2024年2月25日，星期天2.原核细胞的mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽，而真核细胞的mRNA最多只能编码一个多肽。我们把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA（monocistronicmRNA），把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA（polycistronicmRNA）。几乎所有mRNA都可以被分成3部分：编码区和位于AUG之前的5’端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的3’端下游非编码区。编码区从起始密码子AUG开始经一连串编码氨基酸的密码子直至终止密码子。第79页,共138页，2024年2月25日，星期天对于第一个顺反子来说，一旦mRNA的5'端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控。第80页,共138页，2024年2月25日，星期天第一个蛋白质合成终止以后，核糖体分解成大、小亚基，脱离mRNA模板，第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始。前一个多肽翻译完成以后，核糖体大、小亚基分离，小亚基也可能不离开mRNA模板，而是迅速与游离的大亚基结合，启动第二个多肽的合成。第81页,共138页，2024年2月25日，星期天一个顺反子的翻译有时完全取决于它前面顺反子的翻译，在噬菌体RNA中，往往形成复杂的二级结构，因为只有第一个翻译起始位点是暴露的，在这个顺反子翻译产生多肽的过程中，核糖体的运动破坏了后续顺反子的二级结构，使起始位点较容易与核糖体相结合形成起始复合物。第82页,共138页，2024年2月25日，星期天3.原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的多聚（A）结构。原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列（Shine–Dalgarnosequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA3'端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。4.原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子，而真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子。第83页,共138页，2024年2月25日，星期天原核第84页,共138页，2024年2月25日，星期天第85页,共138页，2024年2月25日，星期天3.3.2真核生物mRNA的特征编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶II进行转录，几乎都是单顺反子，其长度在几百到几千个核苷酸之间。一个完整的基因，不但包括编码区（codingregion），还包括5'和3'端长度不等的特异性序列，它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。第86页,共138页，2024年2月25日，星期天“基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！真核生物mRNA结构上的最大特征是5’端的帽子及3’的多聚(A)结构。Agenecanbedefinedasfollowing:TheentirenucleicacidsequencethatisnecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptideorRNAmolecule.第87页,共138页，2024年2月25日，星期天第88页,共138页，2024年2月25日，星期天1.真核生物mRNA的5’端存在“帽子”结构。真核生物基因转录一般从嘌呤（主要是A，也可能是G）起始，其5’端大都经过修饰，第一个核苷酸保留了5’端的三磷酸基团。用核酸酶处理成熟mRNA，其5’端并不产生预期的核苷三磷酸，而产生以5’-5’三磷酸基团相连的二核苷酸，5’终端是一个在mRNA转录后加上去的甲基化鸟嘌呤。第89页,共138页，2024年2月25日，星期天真核细胞mRNA的结构特点AAAAAAA-OH5´

“帽子”PolyA3´

顺反子mRNAm7G-5´ppp-N-3´p第90页,共138页，2024年2月25日，星期天第91页,共138页，2024年2月25日，星期天mRNA的帽子结构常常被甲基化。第一个甲基出现在所有真核细胞的mRNA中（单细胞真核生物mRNA主要是这个结构），由尿苷酸-7甲基转移酶催化，称为零类帽子（cap0）。如在第二个核苷酸(原mRNA5’第一位)的2’-OH位上加另一个甲基，这步反应由2’-O-甲基转移酶完成。一般把有这两个甲基的结构称为1类帽子（cap1），真核生物中以这类帽子结构为主。当mRNA原第二位核苷酸是腺嘌呤时，其N6位有时也被甲基化，这一反应只能在2’-OH被甲基化以后才能发生。在某些生物细胞内，mRNA链上的第三个核苷酸的2’-OH位也可能被甲基化，因为这个反应只以带有1类帽子的mRNA为底物，所以被称为2类帽子（cap2）。有2类帽子的mRNA只占有帽mRNA总量的10%-15%以下。第92页,共138页，2024年2月25日，星期天2.绝大多数真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3’末端都有多聚（A）序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40-200个左右。真核基因的3’末端转录终止位点上游15～30bp处的保守序列AAUAAA对于初级转录产物的准确切割及加多聚（A）是必需的。第93页,共138页，2024年2月25日，星期天真核生物mRNA中的加多聚A反应第94页,共138页，2024年2月25日，星期天多聚(A)是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA在细胞质中的稳定性。mRNA刚从细胞核进入细胞质时，其多聚(A)尾巴一般比较长，随着mRNA在细胞质内逗留时间延长，多聚(A)逐渐变短消失，mRNA进入降解过程。第95页,共138页，2024年2月25日，星期天3.4RNAPolI和PolIII介导的基因转录RNAPolI只用于合成pre-rRNA．有三大特征：1.pre-rRNA组成一个长的转录单元；2.真核生物基因组上rDNA区中成熟rRNA基因相对位置和方向永远相同（５’－＞18Ｓ，5.8S和28S－＞３’)；3.无论原核还是真核生物中，pre-rRNA转录单元都显著长于成熟rRNA的总和。第96页,共138页，2024年2月25日，星期天转录间隔区染色体中保留区非转录间隔区第97页,共138页，2024年2月25日，星期天3.5内含子的剪接、编辑及化学修饰3.5.1RNA中的内含子因为真核基因表达往往伴随着RNA的剪接过程（splicing），从mRNA前体分子中切除被称为内含子（intron）的非编码区，并使基因中被称为外显子（exon）的编码区拼接形成成熟mRNA。第98页,共138页，2024年2月25日，星期天用DNA-RNA杂交的方法验证鸡卵清蛋白基因中存在非编码的内含子区成熟mRNA与带有该基因的互补链DNA序列杂交示意图；b.鸡卵清蛋白的基因结构示意图。第99页,共138页，2024年2月25日，星期天真核基因大多是断裂的，也就是说，一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。研究表明，内含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超过99%。部分人类基因中内含子序列所占的比重分析第100页,共138页，2024年2月25日，星期天所谓断裂基因是指基因的编码序列在DNA分子上不是连续排列的，而是被不编码的序列所隔开。构成断裂基因的DNA序列被分为两类：基因中编码的序列称为外显子，外显子是基因中对应于信使RNA序列的区域；不编码的间隔序列称为内含子，内含子是从信使RNA中消失的区域。断裂基因由一系列交替存在的外显子和内含子构成，基因两端起始和结束于外显子，对应于其转录产物RNA的5´和3´末端。什么是断裂基因？第101页,共138页，2024年2月25日，星期天由DNA转录生成的原始转录产物——核不均一RNA（hnRNA,

heterogeneousnuclearRNA），即mRNA的前体，经过5’加“帽”和3’酶切加多聚腺苷酸，再经过RNA的剪接，编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可译框（openreadingframe，ORF），通过核孔进入细胞质，作为蛋白质合成的模板。第102页,共138页，2024年2月25日，星期天原始转录产物的生成及其主要加工剪接过程图示第103页,共138页，2024年2月25日，星期天真核基因平均含有8-10个内含子，前体分子一般比成熟mRNA大4-10倍。内含子的“功能”及其在生物进化中的地位是一个引人注目的问题。许多人类疾病是内含子剪接异常引起的。地中海贫血病人的珠蛋白基因中，大约有1/4的核苷酸突变发生在内含子的5'或3'边界保守序列上，或者直接干扰了前体mRNA的正常剪接。第104页,共138页，2024年2月25日，星期天转录后加工转录后的加工（posttranscriptionalmodification）（1）减少部分片段：如切除5'端前导序列，

3'端拖尾序列和中部的内含子；（2）增加部分片段：5'加帽，3'加poly(A),

归巢和通过编辑加入一些碱基；（3）修饰：对某些碱基进行甲基化等。第105页,共138页，2024年2月25日，星期天一、tRNA和rRNA的加工（一）、原核的tRNA和rRNA的加工参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物(1)它们的5'端都是单磷酸，而原始的转录产物5'应是三磷酸；(2)分子比初始转录物小；(3)tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。第106页,共138页，2024年2月25日，星期天tRNA的加工tRNA的加工分成3个阶段(1)“斩头”，形成5'末端；(2)去尾，形成3'-OH末端。缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。(3)修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（m2G），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA)第107页,共138页，2024年2月25日，星期天

（二）、真核的tRNA和rRNA的加工真核tRNA的基因和原核不同：(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因；(3)5'端单磷酸核苷酸，表明已被加工过；(4)tRNA的前体分子中含有内含子。第108页,共138页，2024年2月25日，星期天真核tRNA的加工和原核的区别(1)真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；(2)增加了剪接内含子的过程；(3)都要加CCA。第109页,共138页，2024年2月25日，星期天真核细胞中rRNA的加工途径(1)切除5'端的前导序列；(2)从41S的中间产物中先切下18S的片段。

Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）；L细胞的切点在18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。(3)部分退火，形成发夹结构；(4)最后修正。第110页,共138页，2024年2月25日，星期天切点在18S和5.8S之间的ITS处切点在18S序列和ITS的交界处第111页,共138页，2024年2月25日，星期天前体mRNA的加工mRNA前体分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不经过加工。真核mRNA的加工一般要经过四步：

(1)5'加帽；

(2)3'加尾；

(3)切除内含子；

(4)修饰：对某些碱基进行甲基化。第112页,共138页，2024年2月25日，星期天二、真核mRNA前体的加工(一)核内不均一RNA(heterogenousnuclearRNA,hnRNA)平均分子长度为8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均长度（1.8~2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。hnRNA是mRNA的前体，证据是：

(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；

(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；

(3)两者5'端都有帽子结构；

(4)二者为相同的聚合酶所合成；

(5)两者的3‘端都有多聚腺苷酸尾巴。第113页,共138页，2024年2月25日，星期天hnRNA的结构特点：(1)5'端有帽子结构；(2)3'端有poly（A）尾巴；(3)帽子结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；(4)有重复序列，位于寡聚U区后面；(5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；(6)非重复序列中有内含子区。第114页,共138页，2024年2月25日，星期天第115页,共138页，2024年2月25日，星期天1．加帽(1)剪接前加帽如呼肠病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如疱疹病毒和口炎病毒第116页,共138页，2024年2月25日，星期天第117页,共138页，2024年2月25日，星期天第118页,共138页，2024年2月25日，星期天帽子的类型在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2'-0位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap1)；此外，在第三个核苷酸的核糖上（2'-0）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）。这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontdenucleotidestructu