兽药残留检测技术

使用兽药目标防治食品动物疾病促进生长提升饲料利用率兽药残留检测技术第1页兽药使用情况据1966~1974年统计,美国大约已经有78%~80%食品动物,在其一生中或多或少服用过药品。兽药残留检测技术第2页兽药残留兽药残留是指动物性产品任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。兽药最高残留限量（MRL）：是指某种兽药而在食物中或食物表面产生最高允许兽药残留量（单位μg/kg,以鲜重计）。兽药残留主要是因为各种正惯用药和药品滥用造成,另外,休药期过短,是造成动物性食品兽药残留过量另一个主要原因。休药期：是指自末次给药到动物允许屠宰或其动物性产品（乳、蛋等）获准上市间隔时间。兽药残留检测技术第3页兽药危害引发过敏、致畸、致突变及致癌等不良反应。兽药残留检测技术第4页立法为预防动物性食品中可能出现药品残留损害人体健康,1984年在CAC提倡下由联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合发起组织了食品中兽药残留立法委员会(CCRVDF)。CCRVDF主要宗旨是:为控制食品中兽药残留,筛选并建立适合用于全球兽药及其它化学物残留分析方法和取样方法;对兽药残留进行毒理学评价;按制订世界或地域性法规标准(CodexStandart)8个步骤,制订动物组织及产品中兽药最高残留限量(MRL)法规及休药期法规。兽药残留检测技术第5页一、常见兽药按用途分类抗微生物药抗寄生虫药激素类药品生长促进剂抗菌药：磺胺药、呋喃类药、喹诺酮类抗病毒药：干扰素抗蠕虫药抗原虫药杀虫药抗生素：青霉素、链霉素、氯霉素兽药残留检测技术第6页1、抗微生物药抗微生物药是指对病原微生物(细菌、真菌、支原体、病毒等)具抑制或杀灭作用,主要有用于全身感染抗生素、磺胺药及其它化学合成抗菌药。兽药残留检测技术第7页依据化学结构可分类为:(1)氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、安普霉素等。(2)

β-内酰胺类：青霉素、头孢菌素等。(3)四环素类：土霉素、金霉素、多西环素等。(4)氯霉素类：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。(5)大环内酯类：红霉素、吉他霉素、泰乐菌素等。(6)林可胺类：林可霉素、克林霉素。(7)多肽类：杆菌肽、黏菌素等。兽药残留检测技术第8页(8)多烯类：两性霉素、制霉菌素等。(9)磺胺类及抗菌增效剂：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺异唑、磺胺甲基异唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶等。(10)硝基呋喃类：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。(11)喹诺酮类：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、诺氟沙星、环丙沙星、奥比沙星、沙拉沙星、马波沙星等。兽药残留检测技术第9页2、抗寄生虫药抗寄生虫药是指能杀灭或驱除动物体内外寄生虫药品。畜禽寄生虫病危害性极大,会给国民经济造成无法估量巨大经济损失。寄生虫病不但引发大批畜禽死亡,而且严重影响动物生长率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜产品质量下降,数量降低。一些人畜共患寄生虫病,还能直接威胁人类健康和生命安全。兽药残留检测技术第10页依据药品作用特点，抗寄生虫药可分为:(1)抗蠕虫药：苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、有机磷酸酯类、四氢嘧啶类、水杨酰苯胺类、阿维菌素类、哌嗪衍生物等。(2)抗原虫药：聚醚类离子载体抗生素、三嗪类、二硝基类、氯羟吡啶。(3)杀虫药：有机磷化合物、拟除虫菊酯类化合物等。兽药残留检测技术第11页3、激素与其它生长促进剂(1)性激素动物生产中使用性激素,包含雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睾丸酮、丙酸睾酮、氯睾酮)。(2)生长激素是由动物脑垂体分泌天然蛋白质激素,主要经过促进蛋白质合成和脂肪分解来促进动物生长,增加瘦肉率,提升饲料转化率。当前在畜牧业生产中使用主要有牛生长激素(BST)和猪生长激素(PST)。兽药残留检测技术第12页(3)甲状腺素,类甲状腺素及抗甲状腺素。(4)人工合成蛋白质同化激素人工合成蛋白质同化激素可促进动物脑下垂体生长激素分泌。与抗生素一样,伴伴随激素活性物质在畜禽生产中使用种类和数量不停增加,反对使用呼声也越来越高。(5)镇静剂和β-肾上腺素阻断剂为了控制被运输及等候屠宰动物担心,有些畜牧业会非法使用镇静剂和肾上腺素阻滞剂。因为猪对于它们所处环境突然改变尤其敏感,随之产生新陈代谢和担心会影响肉质量。兽药残留检测技术第13页二、常见兽药残留种类与危害

1.抗生素类药品多为天然发酵产物,是临床应用最多一类抗菌药品,如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。兽药残留检测技术第14页2.磺胺类药品主用于抗菌消炎,如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶,磺胺眯,菌得清、新诺明等。近年来,磺胺类药品在动物性食品中残留超标现象,在全部兽药当中是最严重。兽药残留检测技术第15页3.硝基呋喃类药品主用于抗菌消炎,如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。兽药残留检测技术第16页4.抗寄生虫类药品主要用于驱虫或杀虫,如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而惯用苯并咪唑类抗寄生虫药品有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。兽药残留检测技术第17页5.激素类药品主要用于提升动物繁殖和加紧生长发育速度,使用于动物激素有性激素和皮质激素。而以性激素(包含各种内源性性激素、人工合成类似性激素类固醇化合物、人工合成含有性激素一些特征非类固醇化合物)最惯用,如孕酮、睾酮、雌二醇、甲基睾酮,丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。兽药残留检测技术第18页二、食物中兽药残留(1)兽药残留兽药残留是指动物产品任何食用部分所含兽药母体化合物及其代谢物，以及与兽药相关杂质残留。兽药残留检测技术第19页(2)兽药残留起源在食品动物体内或动物性食品中发觉违章残留,大都是由用药错误造成,其原因主要有:①不正确地应用药品,如用药剂量、给药路径、用药部位和用药动物种类等不符适用药指示,这些原因有可能延长药品残留在体内时间,从而需要增加休药天数;②在休药期结束前屠宰动物;③屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检验;④以未经同意药品作为添加剂饲喂动物;兽药残留检测技术第20页⑤药品标签上使用方法指示不妥,造成违章残留物;⑥饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药品容器用于贮藏饲料;⑦接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药品废水和排放污水(如猪经常摄入这种污水);⑧任意以抗生素药渣喂猪或其它食品动物等滥用抗生素,是出现抗生素残留主要原因。兽药残留检测技术第21页(3)兽药残留种类(形式)第一类是以游离或结合形式存在原药及其主要代谢物(除高亲脂性化合物外),因代谢和排泄快速,不会在动物体内蓄积。但这些物质可能含有毒性作用,而且被人摄入后在体内可生成高度活化中间产物(亲电子基团、自由基等),因而对消费者含有潜在危害性。第二类是共价结合代谢物,因其从机体排出相对较慢,它们存在对于靶动物有潜在毒性作用,而对于消费者,因为结合残留在人体内不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只显示很低毒性。兽药残留检测技术第22页残留毒理学意义较大兽药按其用途分类主要包含:抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫类药、生长促进剂和杀虫剂等。抗生素和抗菌素统称抗微生物药品,是最主要兽药添加剂和兽药残留,约占药品添加剂60%。兽药残留检测技术第23页(4)影响食品动物组织中药品残留原因经内服或注射给药动物,其组织中存在药品及其代谢物或降解产物残留。组织中药品残留随药品种类、剂量、给药路径、药品及其代谢物特征不一样而异。在有些情况下,饲料也会影响动物组织中药品残留,但药品休药期执行情况是影响组织残留最主要原因。屠宰后胴体加工过程也是影响药品残留检出率原因之一。烹调和贮藏温度亦影响残留药品在组织中稳定性。兽药残留检测技术第24页对于大多数抗微生物药来说,药品从动物体内消除属一级动力学,而大多数组织中药品残留抗微生物活性丧失是一个零级动力学过程。这表示药品残留量越多,它们从食用组织中消除所需时间就越长。假如药品添加剂是亲脂性,那么它们会蓄积在脂肪组织中,而且其消除速度显著比亲水性药品慢。实际上,存在于家禽食用组织、牛肉、羊肉、乳和蛋中药品残留种类和发生率差异较大。这是动物屠宰前或其乳和蛋上市前停顿用药时间长短一个反应。兽药残留检测技术第25页四、兽药残留现实状况与法规兽药残留主要是因为不合理使用药品治疗动物疾病和作为饲料药品添加剂而引发。1990年出口日本1万吨肉鸡,因为检测出抗球虫药氯羟吡啶残留量超标,要求我国政府销毁全部产品,给我国造成很大经济损失。出口到德国蜂蜜因为农药“杀虫脒”残留超标而被退货,接着欧共体、美国、日本也相继拒绝进口我国蜂蜜,使我国蜂蜜在世界市场上销售发生严重因难。1998年4月,从内地出口到香港生猪,其内脏食后造成17人中毒。其原因是内脏中含有违禁药“盐酸克仑特罗”。另外,我国出口畜禽产品还屡次出现安眠酮类、雌性激素、抗生素等药品残留超标而被取消出口事件。兽药残留检测技术第26页1995年、1996年,欧盟兽医委员会派员对我国进行了考查和评定,认为我国兽医卫生情况达不到欧盟要求,于是做出了从1996年8月1日起,禁止从我国进口禽肉决定。1997年、1998年欧盟又派员来华考查,结果仍达不到其要求。当前,我国肉、蛋、奶出口形势仍相当严峻。我国已开始重视动物性食品中兽药残留问题,制订了各种兽药残留法律和法规,修订了《动物性食品中兽药残留最高限量标准》,并开始建立了全国范围兽药残留监控体系。兽药残留检测技术第27页兽药残留检测技术第28页第六章兽药残留检测技术第二节样品前处理兽药残留检测技术第29页样品前处理是指样品制备和对样品中待测组分进行提取、净化、浓缩过程。样品前处理目标是消除基质干扰、保护仪器、提升检测方法灵敏度、选择性、准确度、精密度。不一样品前处理方法选择，需要依据样品中危害残留物质特点。残留分析中样品主要是各种食用组织(肌肉、脂肪、肝、肾、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)。活体检测中普通采集血浆、尿液和粪便;屠宰场主要采集某种药品靶组织及其它高浓度样本,如肝、肾、胆汁、注射部位组织等。兽药残留检测技术第30页一、生物样品类型兽药残留分析中,最惯用生物样品是组织样品,其次是奶、血液和尿液样品。(1)动物组织肌肉(除去可见脂肪)中水分约占75%,蛋白质(肌浆蛋白、肌原蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖类1.2%,以及一些无机盐、维生素和酶类。肌浆蛋白(肌红蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌动蛋白)溶于浓盐水,胶原蛋白和弹性蛋白(结缔组织)在上述溶剂中均不溶。兽药残留检测技术第31页不一样种类动物食物组成和肌肉成份,如家禽和牛肌红蛋白和脂肪含量存在差异,这些改变会影响分析方法回收率或干扰检测,所以一个动物组织残留分析方法对其它动物组织样品不一定适用。比如,用水提取鸡肉和牛肉组织中呋喃唑酮,回收率在75%以上;一样方法提取猪肌肉样品,回收率仅为10%,改用25%乙腈提取时回收率显著提升,推测呋喃唑酮与猪肉中某种蛋白质结合较强。肝或肾组织为代谢或排泄器官,残留物浓度高,消除迟缓,所以常被作为残留检测靶组织。兽药残留检测技术第32页(2)尿样尿液主要成份是水、尿素及盐类。它是一个良好细菌培养基,因而需马上冷藏或防腐处理。冷藏条件普通可置4℃冰箱内。若欲在室温下保留,应在搜集尿样后,马上加入防腐剂。惯用防腐剂有甲苯、氯仿或改变尿液酸碱性,以抑制细菌繁殖。加入防腐剂是否干扰测定或与被测组分发生化学反应,应由试验验证,方便选取适当防腐办法。兽药残留检测技术第33页在全部体液样品中,尿样最轻易取得,而且样品量多,内含药品(母体药品及代谢物)浓度高;正常尿液中仅含微量蛋白质,不需去蛋白处理。尿中药品大多呈结合状态,主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在,所以不论直接测定或萃取分离之前,都必须将结合态药品水解,使药品游离出来。尿样pH改变范围大,分析前需调整到一致pH值。兽药残留检测技术第34页(3)血样血液采集好之后,因为激活了一系列凝血因子,血中纤维蛋白原形成纤维蛋白,血液逐步凝固,上层析出澄清黄色液体称为血清(serum)。分离血清时,可将凝结后血液置离心机中离心,将上层血清转入另外容器中保留,得到血清,普通可占全血量40%左右。兽药残留检测技术第35页若采血后马上将血液转入有抗凝剂(惯用肝素)容器中,并轻轻摇匀,则血液不再凝结,放置后血细胞会缓缓沉降,1~2h沉降完全,上层黄色液体称为血浆(plasma)。离心使上层血浆与下层血细胞充分分离,将血浆转移至另一容器内供分析。血液经过抗凝取得血浆量,普通比血清稍多,靠近全血量50%。兽药残留检测技术第36页兽药残留检测技术第37页若抗凝血不离心,保持血浆和血细胞混合在一起,则称为全血(wholeblood)。全血样品可冷冻贮存或直接供分析。全血样品放置或自贮存处取出解冻之后,可显著分为上、下两层,上层为血浆,下层为血细胞,但轻微摇动即可混匀。血浆和血清化学成份与组织液相近,测定血浆或血清中药品浓度,比全血更能反应作用部位药浓改变,测定方法普通也可相互通用。因为从抗凝血制备血浆速度较快,而且分离出血浆量比血清多,所以应用血浆比较方便;若血浆中含有抗凝剂对测定有影响,则应使用血清样品。兽药残留检测技术第38页通常药品在血浆中均与血浆蛋白(白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白)发生一定程度结合,一些药品甚至蛋白结合率可达90%以上。所以在萃取之前,必须将结合态药品游离出来。兽药残留检测技术第39页(4)奶样牛奶含水量约87%,蛋白质(以酪蛋白为主)为3.3%,脂肪(甘油三酯)为3.7%,糖类(乳糖)为4.7%,以及一些无机盐、维生素和酶类(过氧化物酶、脂肪酶等)。奶是一个复杂非均相体系。乳脂球主要成份为乳脂,表面包以由酪蛋白、类脂、酶、无机盐和水分组成膜,使乳球能稳定地悬浮在奶中并保护内部乳脂免遭脂肪酶水解,当猛烈振荡时球膜被破坏,脂肪球即相互黏合析出。奶中还含有大量由酪蛋白或脂蛋白组成胶束体系,当酸化或加热时,胶束结构解体,蛋白质沉淀析出。兽药残留检测技术第40页非解离性或极性较低药品易由血浆向奶中扩散,造成奶中残留。与血浆样品类似,奶中药品可与蛋白质结合。所以在萃取之前,必须将结合态药品游离出来。兽药残留检测技术第41页(5)蛋禽蛋包含蛋黄和蛋清。蛋黄含水量约50%、蛋白质16.5%、脂肪33%、糖类0.2%,以及一些无机盐、维生素和酶类(淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和过氧化氢酶)蛋清含水量达88%,蛋白质10.5%和极少许碳水化合物和脂肪。与蛋清相比较,蛋黄基本上为疏水性环境,低极性药品残留较多。兽药残留检测技术第42页假如需要分别测定蛋黄和蛋清中残留,最好将刚产出后蛋分离蛋黄和蛋清,防止药品由蛋黄向蛋清扩散。与尿液类似,蛋成份pH改变范围大,分析前需调整pH值。兽药残留检测技术第43页二、样品制备和贮存样品制备方法，依据法规要求不一样和食品本身特征差异而不一样。有要以全样计,有以脂肪计。普通来说是取可食部分制备样品(除非有其它要求)。如对于肉类有国家法枧要求要以脂肪计算食品安全危害物量,有要求以全样来计算。兽药残留检测技术第44页为确保取样准确性、降低污染和便于保留,对组织样品宜分取一个完整解剖部分,如一个肝叶或一侧完整肾,小动物应摘取完整脏器,并马上密封。样品被绞碎或匀浆后进行缩分。生物样品采样后除马上分析外,都需要在适当条件下保留,目标是防止被测组分发生分解或产生其它化学改变。兽药残留检测技术第45页贮存冷冻保留是最惯用方法,普通冷冻温度为-20℃,此时生物样品如血浆、尿液和组织样品均被冻凝,能够终止样品中酶活性,又能够贮存样品。在一些情况下若搜集样品来不及冷冻处理,可先将其置冰屑中,然后再行冷冻贮存,临用前再融化并放至室温后供测定。兽药残留检测技术第46页对于一些易代谢药品,如磺胺类、聚醚类、同化激素,它们肝和肾脏样品不宜长久存放,理想冷冻温度应为-40℃~-80℃

。为预防含酶样品中被测组分深入代谢,采样后必须马上终止酶活性。常采取方法有:液氮中快速冷冻、微波照射、匀浆及沉淀、加入酶活性阻断剂(通常加入氟化钠)等。一些生物样品中药品易被空气氧化,如儿茶酚类中阿朴吗啡,含有邻苯二酚结构,易被空气氧化产生醌类杂质,若搜集血浆样品不加抗氧剂直接在-15℃冷藏,仅能稳定4周;但加入抗坏血酸后,则可稳定10周。兽药残留检测技术第47页冷冻时,若使用玻璃容器贮存样品,需注意预防温度骤降使容器破裂,造成样品损失或污染。而塑料容器常含有高沸点增塑剂,可能释放到样品中造成污染,而且还会吸留一些药品,引发分析误差。一些药品尤其是碱性药品还会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药品定量回收,所以,必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。兽药残留检测技术第48页三、样品均匀化对于血浆、奶、尿液样品,可置涡旋混合器上混匀,以免造成测定误差。对于肌肉、组织、粪便等半固体样品都存在均匀化这一问题。其中肌肉和组织样品可置匀浆机中均质,粪便样品可加入少许甲醇或其它液体搅匀。同时还应注意取样代表性问题。兽药残留检测技术第49页四、去蛋白处理生物样品如肝脏、肾脏、血浆等含有大量蛋白质,它们能结合药品,所以对于一些药品测定,必须先将与蛋白结合药品游离之后再作深入处理。为何要除去蛋白？？因为生物样品含有大量蛋白质,蛋白质在测定过程中会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定。蛋白质还会污染仪器或恶化测定条件,如直接进样用液相色谱分析含蛋白质体液样品时,蛋白质会沉积在色谱柱上,这不但影响柱效,而且大大缩短色谱柱使用寿命。当前已经有很多去蛋白方法可供使用,但使用各种方法之前应了解该方法是否会造成生物样品中药品发生分解或影响药品提取等。注意方法选择兽药残留检测技术第50页通常去蛋白过程是将蛋白质变性处理后,把与蛋白结合药品解离出来,离心分离以除去蛋白。通常除蛋白方法是在含蛋白样品中加入适当沉淀剂或变性剂,使蛋白质脱水而沉淀(如有机溶剂、中性盐),有是因为蛋白质形成不溶性盐而析出(如一些酸类:三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸),离心后取上清液用于分析。兽药残留检测技术第51页1、有机溶剂沉淀甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白惯用有机溶剂,尤以甲醇和乙腈为最惯用。甲醇与蛋白形成絮状沉淀易于离心分离,得到澄清上清液;乙腈与蛋白形成致密沉淀,易离心除去,沉淀效率较甲醇高。使用时应加入足量沉淀剂,通常加入量为样品体积1.5~2倍。兽药残留检测技术第52页2、酸性沉淀惯用酸性沉淀剂有三氯醋酸和高氯酸,其它还有钨酸、钼酸、磷钨酸、磷钼酸和苦味酸等。酸性沉淀剂能同蛋白质阳离子形成不溶盐而沉淀,必要条件是溶液pH要低于蛋白等电点。加入沉淀剂之后马上形成白色沉淀(必要时可加热使沉淀完全),离心后可得到澄明上清液。兽药残留检测技术第53页三氯醋酸(惯用10%溶液)沉淀蛋白作用很强,所以最常使用,但应注意试剂中含有杂质,将它们引入离心后上清液中,可能会干扰药品分析。其次应注意,当上清液再用乙醚等有机溶剂萃取时,三氯醋酸则连同溶入其内杂质会进入有机相,也可能干扰药品分析。采取高氯酸作为蛋白沉淀剂时,其优点是残留在上清液中ClO4-可加入钾盐除去。兽药残留检测技术第54页3、无机盐沉淀一些无机盐如硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等,能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷,使蛋白质失去胶体性质而沉淀下来。无机盐中以硫酸铵最惯用。惯用重金属盐类有汞盐、铜盐和锌盐等,它们能与蛋白质形成不溶盐而沉淀析出。如可用HgCl2作为蛋白沉淀剂处理血浆样品,离心后用比色法测定上清液中水杨酸浓度。采取蛋白沉淀剂,只要加入足量,普通可除去98%以上蛋白。蛋白沉淀后是否与之相结合药品能游离释出,当前尚缺乏系统研究资料,仅观察到少数现象。兽药残留检测技术第55页4、透析法透析法与超滤法也是除去样品中蛋白方法。透析法很费时,溶质透过膜程度与被测物性质、温度相关,膜需经常更新,极难自动化,所以透析法普通不用于常规分析,而用于药品在生物样品中蛋白结合率研究。兽药残留检测技术第56页5、超滤法超滤法是另一个除去样品中蛋白和其它大分子方法,也是一个薄膜分离技术。与蛋白沉淀法相比,其优点是适合用于小量样品,不稀释试样,也不改变试样pH,尤其适于含对酸碱不稳定化合物样品,用于样品浓缩、脱盐、不一样分子尺寸分离。假如待测物易被某种酶分解,那么超滤除去该酶后就防止了待测物分解。在残留分析中超滤法惯用于牛奶、血液中游离药品浓度和药品-血浆蛋白结合率测定。超滤法缺点是待测物可能被结合在滤膜上而影响回收率,而且一些能与大分子蛋白结合药品也会伴随蛋白质被除去而丢失。兽药残留检测技术第57页五、冷冻干燥冷冻干燥是贮存和预处理一些生物样品有效方法,适合于处理量大样品。比如,一些样品中所含药品水溶性很强(不轻易被有机溶剂萃取),可冻干后再进行液-固萃取。冻干法也适合用于一些含挥发性药品样品以及对热不稳定样品。另外,还有一些生物样品中药品需进行衍生化,若采取常规液-液萃取,在一定温度下挥发去有机溶剂后再进行衍生化,则在加热过程中会造成药品分解或随溶剂一起挥发,所以也宜将这些样品经冻干处理后再行衍生化。兽药残留检测技术第58页生物样品冻干时,可先将其置干冰-丙酮浴中、液氮中或其它低温条件下,半固体样品如粪便、组织等冷冻时间约1~10min。冷冻后水分在样品表面形成“冰壳”,增加了挥发面积,再将其放入冻干机内减压,冰则直接升华,和其它挥发性杂质一起被除去,使样品干燥。冻干后样品通常可直接加入有机溶剂萃取。冻干时应注意一些挥发性强药品可能挥发损失。操作步骤兽药残留检测技术第59页六、结合物水解以结合状态存在药品大多存在于尿中,但也存在于肝脏和血液中。惯用结合物水解方法有:(1)酸水解酸水解通常使用无机酸,如尿样中结合物水解可加入适量盐酸液。加入盐酸浓度、酸化时间以及是否需要加热等,随药品而异,但最终应经过试验确定。水解后样品呈强酸性,必要时可用碱液调整pH后再进行萃取。药品在体内经代谢反应之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等结合物兽药残留检测技术第60页(2)酶水解酶水解是专一性很强水解结合物方法。通常使用水解酶是β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专门水解药品葡萄糖醛酸苷,后者水解药品硫酸酯。也可用二者混合物,将生物样品中药品葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同时水解。尿液中通常存在以上两种结合物,所以混合酶水解法含有实用价值。兽药残留检测技术第61页(3)溶剂解一些药品或内源化合物硫酸酯,可随加入萃取溶剂,在萃取过程中发生分解,通常称为溶剂解。溶剂解也是分解结合物较温和一个方法。兽药残留检测技术第62页七、样品提取和净化1、液-液萃取液-液萃取是经典提取方法之一,它基于被测组分在不相溶两种溶剂中分配。与其它方法相比,液-液萃取法仍是当前最惯用样品处理方法,其原因是:①经过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来,降低杂质对测定干扰;②操作简单快速、经济实用;③可将萃取液蒸发,使组分富集;④可一次进行同类组分萃取。提取→净化→浓缩→色谱分析兽药残留检测技术第63页液-液萃取溶剂选择液-液萃取惯用有机溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。溶剂选择应注意以下几点:①溶剂极性，依据相同相溶原理,极性组分易溶于极性溶剂,反之亦然,应依据被测组分极性选择相同极性溶剂。实际萃取被测组分时,还常于萃取溶剂中加人第二种溶剂,以调整极性,使到达选择性萃取。兽药残留检测技术第64页②溶剂沸点，萃取分离后有机相通常需置温水浴中通压缩空气(或氮气)使挥发,将被测组分浓集,所以萃取溶剂沸点就不应靠近或高于水沸点,不然挥发困难。③溶剂毒性，使用对人体有害溶剂萃取时,应在通风橱内进行。在惯用溶剂中,乙酸乙酯既安全又无毒,对不一样极性被测组分都有较高萃取回收率,又易于挥发,萃取物中混入内源杂质量少,是较理想首选溶剂。兽药残留检测技术第65页④溶剂与水互溶性有溶剂如乙醚,萃取后可混入大约1.2%水分,所以伴随带入一些水溶性杂质。乙醚萃取能力强,又易于挥发浓缩,为惯用萃取溶剂,除去混入水分方法是加入无水Na2SO4脱水,降低混入水溶性杂质量。萃取时于水相中加入有机相后,普通只萃取一次。特殊情况下(如杂质不易除去),则必须将第一次萃取分出含药有机相,再用一定pH水溶液反萃取,最终再从水相将药品萃回到有机相中。兽药残留检测技术第66页萃取溶剂与水百分比萃取过程中加入有机溶剂并非越多越好,而应适量。普通有机相与水相容积比以1:1或2:1为佳,据被测组分性质及方法需要,有时也增加有机相百分比。另外,萃取时若往水相中加入少许比重大有机溶剂(如氯仿),而该溶剂对药品溶解度又比较大,则可将药品从水相中浓集于小体积有机相中,若萃取时使用是尖底试管,则富含药品有机相沉积于管尖部位,可直接取样分析,或将其分离出来。兽药残留检测技术第67页离子对试剂一些酸性或碱性较强有机药品在体液中呈离解状态,成为亲水性极强带电荷离子,即使控制pH也不能抑制它们电离,不能用有机溶剂将其自体液中提取出来。对于上述呈离解状态药品,可加入离子对试剂,使它们形成含有一定脂溶性离子对络合物,用有机溶剂将其从水相中萃取出来。阳离子药品配正确离子对试剂则为阴离子,其中以烷基磺酸盐类(RSO3H)为最惯用。兽药残留检测技术第68页阴离子药品配正确离子对试剂主要为烷基季铵类化合物,可用通式R4N+·X-表示,X-可为酸根或氢氧基,R为烷基。烷基碳链长度惯用C4~C12,甚至可选取C20,碳链越长，则生成离子对络合物脂溶性越高。惯用烷基季铵中有四丁基铵、四戊基铵等,商品试剂惯用其盐,如磷酸四丁基铵、硫酸氢四丁基铵,或为其氢氧化碱,如氢氧化四丁基铵。兽药残留检测技术第69页注意事项：液-液提取有时会发生乳化现象以及被测组分损失。为了预防乳化,可应用较大致积有机溶剂,防止猛烈振摇或加入适当试剂改变其表面张力而破乳,若已发生严重乳化现象,可将试管置于冰箱中冷冻破乳。萃取过程中所用玻璃容器壁对一些药品吸附是不可忽略,尤其是当药品浓度较低时更是如此。除对萃取所用器具进行硅烷化处理以外,还常在萃取剂中加入异戊醇。异戊醇能降低玻璃壁吸附,还可降低萃取过程中乳化形成。也能够加入二乙胺,二乙胺能显著降低吸附作用,提升萃取回收率。兽药残留检测技术第70页2、固相萃取(SPE)固相萃取法(Solidphaseextraction,SPE)是近十几年快速发展起来一个样品预处理技术,它是以液相色谱分离机制为基础建立起来分离和纯化方法。固相分离有两种实现样品纯化路径。一个是保留杂质,待测组分不被保留而自然流出或者被洗脱;更为惯用一个路径是先使待测物完全保留在柱上,使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出,然后以小体积溶剂洗脱待测物。兽药残留检测技术第71页优点：与经典液-液萃取法相比,固相萃取优点有:①快速,普通l~2min即可完成;②回收率高,通常超出90%;③精密度比很好;④样品用量少,有一定选择性,无乳化现象等。兽药残留检测技术第72页SPE柱SPE柱能够是一个玻璃(或塑料)小柱,装入适当填料(固相提取剂),自制固相萃取柱填充疏松,溶剂能自然流出。现在已经有许多不一样形式商品化固相萃取柱,大多数商品化柱都是聚丙烯管型柱,底部压缩装入100~500mg填料。使用时将液体样品从柱上口加入,样液经过固相萃取柱下端流出,液体样品经过柱子时必须施加外力,可在柱下端出口处减压,或于柱上口加压,使样液经过柱床,柱下端流出液可用另一支试管搜集。兽药残留检测技术第73页固相萃取装置和操作过程兽药残留检测技术第74页SPE采取固定相与液相色谱惯用固定相类型相同,惯用固定相有活性炭、硅胶、氧化铝等吸附剂、高分子大孔树脂、离子交换树脂和键合硅胶等。键合硅胶固相提取普通操作步骤以下:①以适当强溶剂湿润固相萃取柱使其溶剂化;②以弱溶剂通常是水或缓冲溶液洗涤固定相,使其到达良好分离状态;③将溶于弱溶剂常是缓冲溶液中样品加到固相提取柱上;④以强度适当弱溶剂,如含有少许甲醇水或缓冲溶液洗涤、除去基质或干扰组分;⑤用强度较高溶剂洗脱待测组分,搜集洗脱液,直接或适当浓缩后进行色谱分析。兽药残留检测技术第75页选择SPE柱选择SPE固定相时,主要依据两个原因:需要提取溶质和样品溶剂。（1）溶质极性：分析物极性与固定相极性非常相同时得到分析物最正确保留。二者极性越相同保留越好以要尽可能选择极性相同固定相。比如萃取碳氢化合物（非极性）要采取反相柱（非极性）。当分析物极性适中时、反相固定相都可使用。兽药残留检测技术第76页（2）溶剂强度固定相选择还受样品溶剂强度制约。样品溶剂强度相对该固定对应该较弱溶剂会增强分析物在吸附剂上保留。假如溶剂太强得不到保留或保留很弱。举例：样品溶剂是正己烷时，反相柱就不适当，因为正己烷是强溶剂，分析物不会有保留；当样品溶剂是水时，能够用反相柱，因为水是弱溶剂，不影响分析物保留。兽药残留检测技术第77页（3）其它原因其它还应该考虑以下几点：①分析物在极性或非极性溶剂中溶解度；②分析物有没有可能离子化，从而决定可否用离子交换固定相；③分析物有没有可能与固定相形成共价键；④不要组分与分析物在固定相结合点上竞争程度。兽药残留检测技术第78页3、基质固相分散技术（MSPD）基本操作：将样品(固态或液态)直接与适量反相键合硅胶一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒表面，制成半固态装柱，然后后采取类似于SPE操作进行洗脱。所用填充料普通为C18或C8，样品和填充料百分比通常为1:4。兽药残留检测技术第79页MSPD是一个在SPE基础上改进后样品处理方法，相对于SPE法，它优点在于：依靠机械剪切力、C18键合相去垢效应和巨大表面积，使样品结构破碎而且在填料表面均匀分散，浓缩了传统样品前处理中所需样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，防止了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成待测物损失，而且固定相处理样品比容量大，提取净化效率较高。MSPD处理样品耗时短、节约溶剂、样品用量少，该方法已被用于近40种兽药残留分析。兽药残留检测技术第80页4、柱切换技术柱切换技术是色谱分析中处理复杂样品方法之一。利用切换阀改变不一样色谱系统，到达在线样品净化、组分富集等目标。此法惯用一个长3~5cm，填以粒径25~40µm填料（类型取决于待测物保留能力）预柱，经过切换阀与分析柱连接。进样后流动相Ⅰ携带样品进入色谱柱，被测组分保留于预柱上，而杂质则随流动相Ⅰ作为废液流出。然后按预先设定程序改变切换阀流路，将流动相Ⅱ引入预柱中，流动相Ⅱ洗脱出被测组分随即进入分析柱，经分离后进入检测器检测。兽药残留检测技术第81页柱切换法优点①操作简单，全自动化，含蛋白样品可直接进样或简单地沉淀蛋白离心后即可进样；②分析结果精密度高，普通无需内标，进样体积普通为0.2~1.0mL（血浆、血清因黏度较大，需稀释后进样），在线处理全过程由计算机程序控制，每个样品在同一预柱相同条件下处理，分析结果RSD普通小于5%。③适于不稳定样品，如易光解、热不稳定样品分析，全部过程在封闭状态下进行，防止了分离、浓缩等操作；④富集作用，提升了检测灵敏度，尤其是极性较大组分，无法用液-液萃取时，柱切换技术尤其奏效。兽药残留检测技术第82页5、超临界流体萃取（SFE）超临界流体萃取是一个较新样品预处理技术，以超临界流体（惯用二氧化碳）作为提取溶剂。超临界流体性质如密度、粘度和扩散性等处于气体和液体之间，而且与温度、压力和流体组成相关。密度越高,其性质越靠近液体;密度越低,其性质越靠近气体。超临界流体既能溶解各种气体不溶解物质,又有气体黏度小、渗透力强等优点,能够快速、高效地将被测物从样品中萃取出来。兽药残留检测技术第83页超临界二氧化碳萃取流程图二氧化碳液体由高压泵输入处于恒温预热管中转化为超临界流体并进入样品管进行萃取。萃取物随流体经过限流管降温后进入有少许填料吸收管内,最终被搜集瓶搜集。超临界流体萃取过程大致可分为下面三步:①待测物质从样品基质中释放出来并扩散、溶解进入超临界流体中；②待测物质从萃取器转移至搜集系统；③降低超临界流体压力，有效地搜集被萃取待测物。兽药残留检测技术第84页对于极性较大或者离子型化合物,可选择氨等萃取剂。压力改变能够改变超临界流体对物质溶解度,所以采取程序升压就能够把溶解度从大到小物质先后从样品中分离出来。依据被萃取物溶解度大小,能够采取动态、循环和静态不一样操作方法。动态法是让流体一次经过样品,这种方法适合溶解度较大样品。静态法是将样品在流体中浸泡一段时间后,再使被萃取物从样品中分离出来。循环法是让一定量流体循环屡次经过样品,循环法既能够萃取难溶物质同时又比静态法萃取速度快。兽药残留检测技术第85页6、固相微萃取（SPME）固相微萃取原理与SPE不一样，是建立在待测物在固定相和水相之间达成平衡分配基础上。其样品前处理和操作也有很大差异。固相微萃取采取熔融石英光导纤维为固相吸附剂,将其浸泡在样品溶液中时,样品中有机物被吸附在光导纤维表面。吸附平衡后经过加热可使被吸附物质解吸,被解吸物质可伴随载气流入气相色谱仪进行分离测定。兽药残留检测技术第86页光导纤维是装在类似于微量注射器固相微萃取针头内,针头起着导向和保护光导纤维不被折断作用。萃取时将针头浸入被萃取液中,吸附平衡后再插入气相色谱进样口。光导纤维吸附量和原始液浓度有一定关系。所以固相微萃取是一个简便、快速、无溶剂前处理技术。兽药残留检测技术第87页固相微萃取法被广泛地应用于样品分析中。包含固态(如沉积物、土壤等)、液态(地下水、地表水、饮用水、废水)及气态(空气及废气)中卤代烃(包含卤代芳烃)、有机氨农药、多环芳烃、胺类化合物以及石油类等。已经有大量应用文件报道。兽药残留检测技术第88页7、免疫亲和色谱IAC免疫亲和色谱(Immµno-afinitychromatograplly,IAC)是以抗原抗体特异性、可逆性免疫结合反应为原理色谱技术,其基本过程为将抗体与惰性基质(如珠状琼脂糖、键合相硅胶)偶联制成固定相,装柱。当含有待测组分样品经过IAC柱时,固定抗体选择性地结合待测物,其它不被识别样本杂质则不受妨碍地流出IAC柱,经洗涤除去杂质后将抗原-抗体复合物解离,待测物被洗脱,样品得到净化。IAC最显著优点在于对待测物高效、高选择性保留能力,尤其适合用于复杂样品痕量组分净化与富集。兽药残留检测技术第89页兽药残留检测技术第90页第六章兽药残留检测技术第三节样品衍生化技术兽药残留检测技术第91页一、衍生化衍生化是将样品中待测组分制成衍生物,使其更适合于特定分析方法。衍生化在色谱分析中作用归纳起来主要有以下几点:①提升检测灵敏度;②改改变合物色谱性能,改进分离效果;③适合深入做化合物结构判定;④扩大色谱分析应用范围。兽药残留检测技术第92页(1)柱前衍生化柱前衍生化是在色谱分离前,预先将样品制成适当衍生物,然后进行分离和检测。优点：衍生化试剂、反应时间和反应条件选择都不受色谱条件限制,衍生化后样品能用各种预处理方法进行纯化和浓缩,也不需要附加特殊仪器设备。缺点：操作比较繁杂费时,轻易引发误差,影响测定准确度。当衍生化试剂分子量相对大时,其引入还可能减小组分间因为分子大小差异而产生色谱保留行为差异。兽药残留检测技术第93页(2)柱后衍生化柱后衍生化是样品经色谱分离后,使衍生化试剂与色谱流出组分在系统内进行反应,然后检测衍生物。优点：操作简便、重复性好,色谱分离相衍生化连续自动进行,而且衍生化不影响组分色谱分离。缺点：需要附加输液泵、混合室和反应器等装置,因为柱出口至检测器间有较长流程,可能发生色谱峰展宽。兽药残留检测技术第94页实现柱后衍生化必须满足以下条件:①衍生化试剂足够稳定,对检测器响应能够忽略,不产生干扰;②衍生化试剂溶液与色谱流动相能相互混溶,混合后不产生沉淀或分层,而且色谱流动相适宜作衍生化反应介质;③衍生化试剂与色谱柱流出液速度要匹配,混合快速且均匀,以免产生噪声;④衍生化反应必须快速和重现性好,反应器设计要合理,以尽可能降低峰展宽。兽药残留检测技术第95页二、HPLC柱后衍生化(1)柱后衍生化装置柱后衍生化使色谱柱至检测器之间增加了混合器与反应器及多个连接部件,这些都将产生柱外效应,造成峰展宽。连接部件产生峰展宽决定于所用材料、长度和内径,需要仔细选择。高效率混合器管式反应器：螺旋型、编织型兽药残留检测技术第96页(2)固相衍生化将固体微粒(硅胶或高分子微球)填充于内径5~6mm、长度25~30cm柱子内就是一个固相衍生化器。固体微粒表面通常经过处理连接有反应基团,叫作固相反应剂。固相反应剂种类很多,包含氧化型、还原型、基团转移型和催化剂型,可适应各种衍生化反应需要。样品经过时与反应剂发生衍生化反应,这是一个非均匀体系反应。大分子只能与担体表面试剂作用,而小分子能够进入担体全部反应部位,所以当有大分子干扰物存在时,只有痕量大分子发生衍生化,不干扰小分子待测物检测。柱后衍生化一个形式兽药残留检测技术第97页特点：①反应试剂局部浓度很高,有利于反应进行完全;②过量衍生化试剂不会进入检测器,降低了检测本底,提升灵敏度;③反应速度取决于溶液接触表面积(填料粒度),因为填料粒度小,因而反应速度快;④反应受色谱流动相影响小;⑤不需额外混合器、管线、接头等,降低了峰展宽原因。兽药残留检测技术第98页(3)固定化酶衍生化最早期把一个酶连接于螺旋管内壁就是最早最简单酶反应器。当代固定化酶反应器都是将酶固定在担体上,这实际上是一个特殊催化剂型固相衍生化试剂。优点：酶反应专一性很强,所以方法选择性很高。固定化后,酶稳定性大大提升,而且能够重复使用。缺点：固定化酶工作稳定性受担体、温度、溶剂、pH和酶抑制剂影响。假如溶剂及其pH不适当,就可能使酶快速失去活性。HPLC流动相中固体微粒、细菌、一些金属离子等都有可能使酶失去活性,应该除去。固相衍生化一个特殊型式兽药残留检测技术第99页(4)光化学衍生化光化学衍生化是使色谱柱流出组分在光照射下发生某种反应,所产生衍生物再被检测器检测。只需在色谱柱与检测器间安装一个光源和一段反应管。光源：高强度紫外灯、激光反应管能够缠绕在光源上,或者编织成套直接套在光电管上。检测器：紫外-可见检测器、荧光检测器或电化学检测器。柱后衍生化一个形式兽药残留检测技术第100页成功光化学衍生化必须符合以下条件:①待测组分能够吸收适宜波长光,能够想象它们应该是芳香或共轭不饱和化合物;②色谱洗脱液对上述波长光应该透明;③光源在上述波优点有足够光通量(光强);④光反应足够快速;⑤反应产物足够稳定,而且能用上述检测器之一进行检测。兽药残留检测技术第101页光化学衍生化主要特点：①价格低廉,光可能是最廉价衍生化试剂;②设备简单,不需额外仪器(泵等),也不需要任何衍生化试剂,降低了污染;③在恒流条件下,有恒定和重现动力学参数。所以,使反应不完全甚至未达平衡,能进行定量测定。兽药残留检测技术第102页三、GC柱后衍生化(1)柱后裂解器裂解器是一个石英或金线圈或者是一个氧化还原器,在反应器后检测分析各色谱组分裂解产生C、H、O和N元素。柱后裂解能对色谱峰进行化学结构判定,这一点与MS作用相同。(2)柱后浓集器柱后浓集器主要用于GC-MS,不过也能改进其它检测器信噪比。浓集器主要有四类,即喷射分离器、烧结玻璃分离器、多孔膜和高聚膜。兽药残留检测技术第103页(3)柱后反应器有一个含有镍-硅藻土催化剂微型反应器,加热至425℃时,能允许氢气自由经过,而其它组分则裂解成甲烷和水。除去水后,以热导池检测甲烷。氢反应器能使色谱峰中含有卤素或氮组分还原成氢卤酸和氨,然后进行库仑检测或电导检测。另一个氢反应器将含氮化合物转变成氨后,再流进一个装置与邻苯二甲醛(OPA)和巯基乙醇反应,并进行荧光检测。兽药残留检测技术第104页四、用于液相色谱化学衍生化须满足要求：①反应能快速、定量地进行,而且对反应条件要求不苛刻;②反应选择性高,最好只与待分析组分发生反应;