微生物发酵机制

发酵类型

依据微生物种类不一样，可分为好氧性发酵、厌氧性发酵和兼性发酵。（1）好氧性发酵：在发酵过程中需要通入一定量无菌空气，满足微生物呼吸需要。

微生物发酵机制第1页（2）厌氧性发酵：在发酵过程中不需要供给无菌空气。

（3）兼性发酵：在有氧、无氧条件下均能生活。如酿酒酵母，在缺氧条件下进行厌气性发酵积累酒精，而在有氧条件下则进行好氧发酵，大量繁殖菌体细胞。微生物发酵机制第2页发酵机制：微生物经过其代谢活动，利用基质（底物）合成人们所需要代谢产物内在规律积累产物微生物菌体酶代谢产物厌气发酵：酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇等好气发酵：有机酸、氨基酸、蛋白质、核苷酸、抗生素、维生素等微生物发酵机制第3页代谢控制发酵：人为改变微生物代谢调控机制，使有用代谢产物过量积累。发酵机制研究内容：1.微生物生理代谢规律（就是各种代谢产物合成路径及代谢调整机制）；2.环境原因（营养条件、培养条件等）对代谢影响及改变代谢办法；微生物发酵机制第4页糖酵解路径及调整机制

葡萄糖经EMP路径：C6H12O6+2ADP+2Pi+2NAD2CH3COCOOH+2ATP+2NADH2微生物发酵机制第5页EMP糖酵解路径微生物发酵机制第6页糖酵解路径及特点

EMP路径大致可分为三个阶段1，6-二磷酸果糖生成，消耗2分子ATP；1，6-二磷酸果糖降解为3-磷酸甘油醛；3-磷酸甘油醛经五步反应转化为丙酮酸，产生4分子ATP

它是动物、植物、微生物细胞中G分解产生能量共同路径。

EMP每一步都是由酶催化。己糖激酶；磷酸果糖激酶（该酶受ATP、柠檬酸抑制，为AMP所激活）；丙酮酸激酶；3-磷酸甘油醛脱氢酶（受碘乙酸抑制）；烯醇化酶（受氟化物抑制）。微生物发酵机制第7页

当以其它糖类作为碳源和能源时，先经过少数几步反应转化为糖酵解路径中间产物，然后沿着糖酵解路径进行降解。丙酮酸不一样去路。反应中生成NADH2不能积存，必须被重新氧化为NAD后，才能继续不停地推进全部反应，在不一样机体，在不一样环境下（如氧气有没有），氢受体不一样，丙酮酸去路也不一样。微生物发酵机制第8页

在无氧条件下：

在乳酸菌中受乳酸脱氢酶作用，丙酮酸作为受氢体而被还原为乳酸，即同型乳酸发酵；

在酵母菌中，丙酮酸受丙酮酸脱羧酶作用生成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶作用下作为受氢体被还原为乙醇，即酒精发酵；

在梭状芽孢杆菌中，丙酮酸脱羧生成乙酰COA，然后经一系列改变生成丁酰COA、丁醛，二者作为受氢体被还原生成丁醇，生成物中还有丙酮、乙醇，所以称为丙酮-丁醇发酵。微生物发酵机制第9页乙醇乳酸微生物发酵机制第10页在好氧发酵条件丙酮酸进入TCA环，进行代谢，产生各种好氧代谢产物或完全氧化取得能量。微生物发酵机制第11页B、

三羧酸循环三羧酸循环一定需要氧才能进行。在三羧酸循环中脱下氢，形成NADH和FADH2，然后再逐步传递给氧。微生物发酵机制第12页丙酮酸三个二氧化碳三羧酸循环微生物发酵机制第13页A.厌氧发酵机制微生物发酵机制第14页第一节酒精发酵机制1酵母菌酒精发酵

微生物发酵机制第15页

1.1酒精生成机制(1)葡萄糖（glucose）EMP丙酮酸（pyruvicacid）己糖磷酸化作用EMP六碳糖转变为三碳糖磷酸丙糖丙酮酸(2)丙酮酸乙醇丙酮酸丙酮酸脱羧酶乙醛（acetaldehyde）乙醛乙醇脱氢酶乙醇（alcohol）

由葡萄糖生成乙醇总反应式为

C6H12O6+2ADP+2H3PO4

2CH3CH2OH+2CO2+2ATP微生物发酵机制第16页酵母菌在无氧条件下，经过以上12步反应，1分子G生成２分子乙醇，２分子CO2和2分子ATP。则1mol葡萄糖生成2mol乙醇，理论转化率为2×46.05/180.1×100%=51.1%不过在生产中大约有5%葡萄糖用于合成酵母细胞和副产物，实际上乙醇生成量约为理论值95%，则乙醇对糖实际转化率约为48.5%。

微生物发酵机制第17页巴斯德效应巴斯德效应:好气条件下，酵母菌发酵能力下降（细胞内糖代谢降低，乙醇积累降低）；好气条件下，代谢进入TCA环→柠檬酸↑、ATP↑→抑制激酶→6-P-葡萄糖↑→反馈抑制己糖激酶→抑制葡萄糖进入细胞内→葡萄糖利用降低。

微生物发酵机制第18页同时，好气条件下，丙酮酸激酶活性降低。丙酮酸激酶活性降低也是因为磷酸果糖激酶活性降低所致。丙酮酸激酶活性↓→使磷酸烯醇式丙酮酸↑→反馈抑制己糖激酶活性→糖酵解速度↓微生物发酵机制第19页

1.2酒精发酵中副产物形成

主产物（product）：乙醇（alcohol）副产物（byproduct）：40各种二氧化碳（carbondioxide）甘油（glycerol）乙醛（acetaldehyde）琥珀酸（succinicacid）乙酸（aceticacid）酯（ester）高级醇（higheralcohol）双乙酰（diacetyl）微生物发酵机制第20页1.2.1杂醇油生成杂醇油是碳原子数大于2脂肪族醇类统称，主要由正丙醇、异丁醇、异戊醇和活性戊醇组成，这些高级醇是组成酒类风味主要组成成份之一，当其过量时会影响产品质量，是酒类产品中质量指标之一，应给予控制。1.2.1.1酒精发酵中高级醇形成路径a.氨基酸氧化脱氨作用b．由葡萄糖直接生成微生物发酵机制第21页酒精发酵中高级醇形成路径（1）氨基酸氧化脱氨作用缬氨酸异丁醇异亮氨酸活性戊醛酪氨酸酪醇苯丙氨酸苯乙醇

亮氨酸＋ɑ－酮戊二酸ɑ－酮异己酸转氨酶+谷氨酸异戊醇异戊酸醇脱氢酶微生物发酵机制第22页（2）由葡萄糖直接生成ɑ－酮酸（碳原子低）活性乙醛ɑ－酮酸（碳原子高）还原、异构、脱水醇＋缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸醇微生物发酵机制第23页1.2.1.2影响杂醇油形成条件a.菌种:在一样条件下，不一样菌种杂醇油生成量相差很大。酵母杂醇油生成量与醇脱氢酶活性关系亲密，该酶活力高，杂醇油生成量大。b.培养基组成:培养基中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）存在，可增加对应高级醇（异戊醇、活性戊醇和异丁醇）生成量。培养基中氮水平高，形成杂醇油量少，杂醇油总形成量因氮水平高而降低。c.发酵条件:普通发酵温度高，高级醇生成量高，通风有利于高级醇生成。高级醇生成与乙醇生成是平行，随乙醇生成而生成。微生物发酵机制第24页1.2.2双乙酰（diacetyl）1.2.2.1双乙酰合成路径双乙酰是啤酒生产过程中主要成份，它是酵母细胞内生物合成缬氨酸、亮氨酸中间产物；也是衡量啤酒成熟和质量水平主要指标。它赋予啤酒一个不愉快馊味，淡色贮藏啤哂双乙酰含量应控制在0.1mg/L以下。双乙酰是α-乙酰乳酸在酵母细胞外非酶氧化产物，是酵母在生长繁殖时，在酵母细胞体内用可发酵性糖经α-乙酰乳酸合成它所需缬氨酸、亮氨酸路径中副产物，中间产物α-乙酰乳酸部分排出酵母细胞体外，经氧化脱羧作用生成双乙酰。微生物发酵机制第25页CH3CHO-TPP(活性乙醛)CH3COCOOH-乙酰乳酸缬氨酸双乙酰2,3-丁二醇非酶氧化酵母还原+双乙酰合成消除路径微生物发酵机制第26页1.2.2.2双乙酰消除办法:１.提升麦汁中氨基氮含量；提升麦汁中缬氮酸含量经过反馈作用，抑制从丙酮酸合成缬氨酸支路代谢作用。２.利用酵母还原作用，将双乙酰转变成2,3-丁二醇；３.利用二氧化碳洗涤作用，排除双乙酰。4.加入-乙酰乳酸脱羧酶;5.使用基因工程构建含有-乙酰乳酸脱羧酶酵母菌株微生物发酵机制第27页

酯是啤酒香味主要组成成份，它是经过酯酰辅酶A与醇缩合而形成。传统淡色啤酒以酒花香为主体香，含有适量酯，才使啤酒香味丰满协调。过高酯含量会使啤洒有不愉快香味。近代啤酒中酯含量与高级醇一样，普遍有升高趋势。有酒其乙酸乙酯大于阈值，有淡雅果实香味，也成为一个独特风味。1.3酯类物质微生物发酵机制第28页啤酒香味果酒香味酒花香麦芽香发酵过程形成各种酯类香味果香发酵香陈酿香形成路径：通式：R-CO-SCOA+R

OHRCOOR

+COA-SHR-CO-SCOA脂肪酸激活作用酮酸氧化作用微生物发酵机制第29页在ATP作用下，使脂肪酸活化酮酸氧化作用R-COOH+ATP+COA-SHRCO－SCOA+AMP+PPi

RCOCOOH+NAD+COASHRCO-SCOA+NADH2+CO2

影响酯含量原因:a.酵母菌种，不一样酵母菌种，发酵时形成酯量是不一样；b.发酵温度高，有利于酯类形成；c.接种量大，酯类形成量低。微生物发酵机制第30页2.细菌酒精发酵（alcoholicfermentationofbacteria)

菌种为运动发酵单孢菌（ZymomonasMobilis），少数假单胞杆菌（Pseudomonas），如林氏假单胞菌（Ps.lindneri）能利用G经ED路径进行酒精发酵。总反应式为

C6H12O6+ADP+H3PO4→2C2H5OH+2CO2+ATP

产物和酵母菌酒精发酵相同，但产能水平各异。

微生物发酵机制第31页ED路径(脱氧酮糖酸路径)由部分EMP路径、部分HMP路径组成

ED路径

三个阶段

1、G氧化分解6--磷酸葡萄糖酸+NADP·H（HMP）

2、6--磷酸葡萄糖酸三碳糖

6---P--葡萄糖酸脱水酶

6---P--葡萄糖酸2--酮--3--脱氧--6--P--葡萄糖酸2--酮--3--脱氧--6--P--葡萄糖酸丙酮酸+3--P--甘油醛3、氧化产能阶段

3--P--甘油醛EMP丙酮酸

总反应式C6H12O6+NADP++NAD++ADP+Pi2CH3COCOOH+NAD·2H++NADP·2H+ATP

微生物发酵机制第32页

细菌酒精发酵特点代谢速度快；发酵周期短，比酵母菌酒精产率高；厌氧且耐高温；能利用各种糖类发酵工艺技术要求高优点：缺点：微生物发酵机制第33页第二节乳酸发酵机制一、同型乳酸发酵：

进行乳酸发酵主要是细菌。它们利用糖经糖酵解路径生成丙酮酸，丙酮酸还原产生乳酸。发酵产物中主要为乳酸称为同型乳酸发酵。如乳链球菌（Streptococcuslactics）、乳酪链球菌（Streptococcuscremoris）、干酪乳杆菌（lactobacilluscasei）、保加利亚乳杆菌（Lac.bulgaricus）等。微生物发酵机制第34页

2H（乳酸脱氢酶）C6H12O6

EMP

2CH3COCOOH

2CH3CHOHCOOH

同型乳酸发酵特点：

1molG产生2mol乳酸，理论转化率是100%。另外有极少许乙醇、乙酸和二氧化碳等。微生物发酵机制第35页二、异型乳酸发酵

发酵产物中除乳酸外同时还有百分比较高乙酸、乙醇、二氧化碳等，称为异型乳酸发酵。其生物合成路径有两种。

1.6-磷酸葡萄糖酸路径：葡萄糖经6-磷酸葡萄糖生成5-磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成5-磷酸木酮糖；后者经磷酸解酮酶催化，分解为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶作用变为乙酰CoA，再经乙醛脱氢酶作用生成乙醇。而3-磷酸甘油醛经EMP路径生成丙酮酸。后者经乳酸脱氢酶催化还原为乳酸。

微生物发酵机制第36页葡萄糖ATPADP6－磷酸葡萄糖1NADNADH＋H＋6－磷酸葡萄糖酸2NADNADH＋H＋5－磷酸核酮糖35－磷酸木酮糖乙酰磷酸乙酰乙酰CoANADH＋H＋NAD乙醛NADH＋H＋NAD乙醇3－磷酸甘油醛乳酸ADPATPNADNADH＋H＋NADNADH＋H＋485766－磷酸葡萄糖酸生成乳酸和乙醇己糖激酶6－磷酸葡萄糖脱氢酶6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶4.5－磷酸核酮糖－3－差向异构酶5.磷酸解酮酶6.磷酸转乙酰酶7.乙醛脱氢酶8.醇脱氢酶微生物发酵机制第37页

经过该路径，1molG产生1mol乳酸，乳酸对糖理论转化率是50%。另外有百分比较高乙醇、乙酸和二氧化碳等。

肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）及葡聚糖明串珠菌（Leuconostocdextranicum）经过该路径进行异型乳酸发酵。微生物发酵机制第38页2.Bifidus路径（双歧路径）：双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)进行乳酸发酵也是一条磷酸解酮酶路径。该路径特点是：①有两个磷酸解酮酶参加；

②在没有氧化作用和脱氢作用下，2分子G分解为3分子乙酸和2分子3-磷酸甘油醛。接着，在3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶参加下，3-磷酸甘油醛转化为乳酸，转化率为50%。微生物发酵机制第39页葡萄糖ATPADP6－磷酸果糖6－磷酸果糖ADPPi4－磷酸赤藓糖3－磷酸甘油醛7－磷酸景天庚酮糖5－磷酸木酮糖5－磷酸核糖乙酰磷酸ATP乙酰5－磷酸木酮糖5－磷酸核酮糖乙酰磷酸2分子3－磷酸甘油醛乳酸ADPATPNAD＋NADH＋H＋NAD＋NADH＋H＋ADPATP3分子乙酸葡萄糖经双歧路径发酵生成乳酸和乙酸13245676-磷酸果糖解酮酶转二羟基丙酮基酶转羟乙醛基酶5－磷酸核糖异构酶5－磷酸核酮糖－3－差向异构酶5－磷酸木酮糖磷酸酮解酶乙酸激酶

微生物发酵机制第40页第三节甘油发酵机制一、亚硫酸盐法甘油发酵酵母菌在酒精发酵时，如加入亚硫酸氢钠等盐类，它能与乙醛起加成作用，生成难溶结晶状亚硫酸钠加成物，这么就使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮作为受氢体，在α-磷酸甘油脱氢酶（NAD为辅酶）催化下生成α-磷酸甘油，后者在α-磷酸甘油磷酸酯酶催化下生成α-甘油。CH2OHOHC6H12O6+NaHSO3→CHOH+CH3-

C-HOSO2Na+CO2

CH2OH

微生物发酵机制第41页2ATP2ADP2ADP2ATPCO2NaHSO3NAD﹢NADH+H﹢NADH+H＋NAD﹢H2OPi酵母菌酒精发酵Ⅱ型葡萄糖1.6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮丙酮酸乙醛乙醛HSO3α-磷酸甘油甘油微生物发酵机制第42页

1mol葡萄糖只产生1mol甘油，不产生ATP，整个过程无ATP积余，可见在甘油发酵过程中亚硫酸盐不能加得太多，不然会使酵母菌因得不到能量而终止发酵，必须留一部分酒精发酵，以使取得一些能量，供生命活动所需。该过程也称酵母菌II型发酵。

微生物发酵机制第43页二碱法甘油发酵

酒精酵母发酵液在保持碱性（pH7.6以上）条件下，乙醛不能作为正常受氢体，乙醛在碱性溶液里２分子乙醛之间发生歧化反应，相互氧化还原，生成等量乙醇和乙酸。此时，由３－磷酸甘油醛脱氢生成NADH+H+用来还原磷酸二羟丙酮，并进而生成甘油．CH2OH2C6H12O6+H2O2CHOH+C2H5O

H+CH3COOH+2CO2

CH2OH

碱法甘油发酵产品有甘油、乙醇、乙酸，也不产生ATP，所以此法只能在酵母非生长情况下进行发酵。该过程也称酵母菌Ⅲ型发酵。微生物发酵机制第44页

第四节沼气发酵机制沼气（biogas）(甲烷，methane)

甲烷发酵属于厌氧消化(anaerobicdigestion)处理，是有机物厌氧分解过程中主要过程。利用厌氧菌将工厂废水、下水污泥中所含有有机物进行分解，不用对培养基进行灭菌和纯种培养和接种操作。它能够作为好氧处理前阶段处理。甲烷气体（沼气）是生物燃气主要组员。

微生物发酵机制第45页

一、甲烷发酵机理

甲烷发酵是厌氧菌将碳水化合物、脂肪、蛋白质等复杂有机物最终分解成甲烷和CO2，甲烷发酵不是由单一甲烷产生菌所能完成，甲烷发酵最少由三个阶段组成：

第一个阶段是有机聚合物水解生成单体化合物，进而分解成各种脂肪酸、CO2和H2；第二阶段是各类脂肪酸进行分解，生成乙酸、CO2和H2；第三个阶段是由乙酸和CO2及H2反应生成甲烷；

微生物发酵机制第46页前两个阶段也可统称为产酸阶段，产酸阶段也叫液化阶段，参加这一阶段反应微生物大部分是兼性厌氧细菌，只有少数原生动物、霉菌和酵母参加这一反应。发酵液中这一类非甲烷产生菌数量大致上与甲烷产生菌相等。第三个阶段产气称为甲烷发酵，参加这一过程细菌总称为甲烷菌。

微生物发酵机制第47页

复杂有机物

←发酵细菌

可溶性简单有机物

←产酸菌

挥发性脂肪酸（丙酸，异丁酸，异戊酸）专性质子还原菌醋酸H2+HCO3

纯醋酸菌CH4

甲烷菌CH4

HCO3

H

+HCO3

H2CO3

H2O+CO2H2O微生物发酵机制第48页

二、甲烷发酵微生物

产酸阶段也叫液化阶段，参加微生物大部分是兼性厌氧菌，只有少许原生动物、霉菌和酵母参加这一反应。产酸阶段细菌有：梭菌属（Clostridium）；芽孢杆菌（Bacillus）；葡萄球菌属（Staphlococccus）；变形杆菌属（Froteis）；杆菌属(Bacterium)。

微生物发酵机制第49页甲烷产生阶段主要是甲烷产生菌参加。产甲烷菌是严格厌氧菌，不产孢子。采取新厌气培养技术，能够分离得到20种以上甲烷产生菌，如：甲烷杆菌属（Methanobacterium）；甲烷短杆菌属（Methanobrevibacterium）；产甲烷菌属（Methanococci）；甲烷微球菌属（Methanomicrobium）等细菌。微生物发酵机制第50页

各种甲烷菌之间在RNA排列次序上都很相同，它们都是含有嗜盐性，而且比经典细菌耐温和耐酸。所以有些人将甲烷菌和嗜盐菌、嗜热菌、嗜酸菌等一起分类属于古细菌。甲烷菌和非甲烷菌叫沼气菌（biogasproducingbacteria）。发酵液中非甲烷产生菌数量与甲烷产生菌相等，达106~108个/ml。甲烷发酵三个阶段是相互依赖和连续进行，并保持动态平衡。假如平衡遭到破坏，沼气发酵就受到影响，甚至停顿。微生物发酵机制第51页三、甲烷发酵各种条件

1)菌种培养：取自然界正在进行甲烷发酵河沟或沼泽底部污泥或工厂废水加入甲烷发酵槽，保持适当温度，使细菌繁殖；2)发酵温度：中温发酵37C~38

C；高温发酵53C~54

C；在一个温度下长久连续培养，在另一个温度下就极难取得满意效果，这是因为两类甲烷菌种类不一样造成。高温发酵处理能力较低温发酵大2.5倍。微生物发酵机制第52页3)废水组成：废水中要有营养，除作为能源碳源外，还有氮源。废水中磷不足，可用化肥补充，甲烷发酵最适pＨ值为7，不适时，可进行中和；4)污泥浓度：甲烷发酵中，连续进行厌氧污泥将在液体中积累，含有甲烷细菌体、碳酸盐、氢氧化钠、硫化物、未分解污泥残渣，污泥越多，越能促进甲烷发酵；5)抑制物：有硫化物、硝酸盐、许多重金属、洗涤剂和醇类尤其是不饱和醇，首先抑制甲烷菌，使气体降低，抑制物浓度再高，产酸菌也受到抑制。微生物发酵机制第53页B.好氧发酵机制微生物发酵机制第54页

好氧性发酵(aerobicfermentation)：在发酵过程中需要不停地通入一定量无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸发酵、利用黄单孢菌进行黄原胶－多糖发酵等等．糖分解代谢包含糖酵解（糖共同分解路径）和三羧酸环（糖最终氧化路径）。微生物发酵机制第55页第一节柠檬酸发酵机制一、柠檬酸合成路径

黑曲霉(Asp.niger)原料：糖类，乙醇，醋酸路径：EMP（HMP）丙酮酸羧化TCA环黑曲霉生长，EMP与HMP路径比率是2：1，生产柠檬酸时为4：1。葡萄糖柠檬酸(citricacid)理论转化率：106.7%微生物发酵机制第56页柠檬酸发酵机制柠檬酸在食品中应用柠檬酸发酵微生物柠檬酸发酵机理微生物发酵机制第57页1)

饮料与冰淇淋柠檬酸广泛用于配制各种水果型饮料以及软饮料柠檬酸本身是果汁天然成份之一，不但赋于饮料水果风味，而且含有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中糖、香精、色素等成份交融协调，形成适宜口味和风味；添加柠檬酸能够改进冰淇淋口味，增加乳化稳定性，预防氧化作用。微生物发酵机制第58页2)

果酱与酿造酒柠檬酸在果酱与果冻中一样能够促进风味，并使产品抗氧化作用。因为果酱、果冻凝胶性质需要一定范围pH值，添加一定量柠檬酸能够满足这一要求。当葡萄或其它酿酒原料成熟过分而酸度不足时，能够用柠檬酸调整，以预防所酿造酒口味薄弱。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素作用，以保护果汁新鲜感和预防变色。微生物发酵机制第59页3)

腌制品

各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸能够改进风味，除腥去臭，抗氧化。微生物发酵机制第60页4)

罐头食品

加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子作用，保护其中抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似作用。微生物发酵机制第61页5)

豆制品及调味品用含有柠檬酸水浸渍大豆，能够脱腥并便于后续加工。柠檬酸能够用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白水解，生产出风味别致调味品。它也能够用于成熟调味品（酱油等）调味。微生物发酵机制第62页6)

其它柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定作用。柠檬酸铁胺能够用作补血剂；柠檬酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。微生物发酵机制第63页柠檬酸消费领域：饮料行业占40～45％食品添加剂等占15～20％洗涤剂占20～30％医药占5％其它占10％年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟和美国为最大消费市场。微生物发酵机制第64页柠檬酸是当前世界上以生物化学方法生产，产量最大有机酸。我国是柠檬酸第一大生产国，预计年产约50万吨欧洲是柠檬酸第二大生产地，产量约30万吨美国柠檬酸年产量约25万吨微生物发酵机制第65页

柠檬酸发酵微生物

黑曲霉分生孢子头微生物发酵机制第66页柠檬酸发酵机理TCA循环与乙醛酸循环柠檬酸积累代谢调整柠檬酸积累机理微生物发酵机制第67页磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A柠檬酸顺乌头酸衣康酸异柠檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰辅酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰辅酶A123316451567891012111413TCA循环与乙醛酸循环柠檬酸合成酶ATP降低限速反应延胡索酸酶关键酶α-酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶微生物发酵机制第68页磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A柠檬酸顺乌头酸衣康酸异柠檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰辅酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰辅酶A123316451567891012111413TCA循环与乙醛酸循环反馈抑制苹果酸脱氢酶CO2参加嘌呤和嘧啶合成脂肪酸天冬氨酸参加蛋白质合成参加蛋白质合成丙酮酸脱氢酶微生物发酵机制第69页葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoACO2柠檬酸生物合成路径实现柠檬酸积累：一、设法阻断代谢路径，实现柠檬酸积累二、代谢路径被阻断部位之后产物，必须有适当补充机制CO2ATPADPCO2ADPATP磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶顺乌头酸酶抑制剂阻断微生物发酵机制第70页柠檬酸发酵机理葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoACO2柠檬酸生物合成路径顺乌头酸酶抑制剂阻断微生物发酵机制第71页柠檬酸积累代谢调整

糖酵解及丙酮酸代谢调整黑曲霉在缺锰培养基中培养时，可提升NH4+浓度，高浓度NH4+可有效解除ATP、柠檬酸对磷酸果糖激酶抑制。微生物发酵机制第72页葡萄糖葡萄糖-6-磷酸ATPADP⑴果糖-6-磷酸ATPADPMg2+⑵果糖-1，6-二磷酸⑶甘油醛-3-磷酸二羟丙酮磷酸⑷⑸2Pi⑹1，3-二磷酸甘油酸2ADP2ATP⑺3-磷酸甘油酸⑻2-磷酸甘油酸2H2OMg2+⑼磷酸烯醇式丙酮酸2ATP2ADP⑽烯醇式丙酮酸丙酮酸乳酸⑾2CO2乙醛+2H+⑿⒀2NAD+2(NADH+H+)+2H+乙醇⒁糖酵解和酒精发酵全过程磷酸果糖激酶AMP无机磷NH4+活化抑制解除柠檬酸微生物发酵机制第73页柠檬酸积累代谢调整三羧酸循环调整柠檬酸×顺乌头酸×异柠檬酸∵顺乌头酸酶含铁非血红蛋白，以Fe4S4作为辅基。且反应需要Fe++∴１适量加入亚铁氰化钾（黄血盐），与Fe++生成络合物，则酶失活或活性降低，而积累柠檬酸。∴２诱变或其它方法，造成生产菌种顺乌头酸酶缺损或活力很低，一样积累柠檬酸。微生物发酵机制第74页磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A柠檬酸顺乌头酸衣康酸异柠檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰辅酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰辅酶A123316451567891012111413TCA循环与乙醛酸循环CO2柠檬酸合成酶高能硫酯键能量Fe2+Fe2+亚铁氰化钾顺乌头酸酶微生物发酵机制第75页葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA柠檬酸积累代谢调整及时补加草酰乙酸外加草酰乙酸回补路径旺盛菌种组成型丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶回补路径顺乌头酸酶抑制剂阻断微生物发酵机制第76页柠檬酸积累代谢调整糖酵解及丙酮酸代谢调整三羧酸循环调整及时补加草酰乙酸葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸乙酰CoA丙酮酸羧化酶回补路径丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸顺乌头酸酶抑制剂阻断微生物发酵机制第77页

1、因为锰缺乏，抑制了蛋白质合成，而造成细胞内NH4+浓度升高，促进了EMP路径通畅。2、由组成型丙酮酸羧化酶源源不停提供草酰乙酸。

柠檬酸积累机理黑曲霉微生物发酵机制第78页柠檬酸积累机理3、在控制Fe++含量情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7微生物发酵机制第79页4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶Ａ和丙酮酸固定CO２反应相平衡柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸能力。

柠檬酸积累机理葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA丙酮酸羧化酶回补路径微生物发酵机制第80页柠檬酸积累机理5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而深入促进了柠檬酸本身积累。柠檬酸×顺乌头酸×异柠檬酸×草酰琥珀酸微生物发酵机制第81页目标产物提供4C化合物TCA循环微生物发酵机制第82页

因为TCA循环降低，ATP生成降低，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内NH4+异常高，从而降低了柠檬酸对PFK抑制。柠檬酸发酵需要下述环境条件：磷酸盐浓度低；氮源为NH4+盐；pH值低（低于2.0）；溶氧量高；Mn2+、Fe2+、

Zn2+含量极低。柠檬酸发酵中黑曲霉对Mn2+极端敏感。黑曲霉在缺锰条件下发酵，细胞有生理和代谢改变。Mn2+效应能够认为是NH4+水平升高而减弱了柠檬酸对EMP路径关键酶（PFK）抑制。微生物发酵机制第83页

柠檬酸积累机理

1、因为锰缺乏，抑制了蛋白质合成，而造成细胞内NH4+浓度升高，促进了EMP路径通畅。2、由组成型丙酮酸羧化酶源源不停提供草酰乙酸。3、在控制Fe++含量情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7微生物发酵机制第84页

第二节醋酸发酵机制淀粉糖酒精醋酸1.醋杆菌发酵酒精成醋酸乙醇向醋酸转化是分两步进行，中间产物是乙醛。CH3CH2OHE1

CH3CHOE2

CH3COOH

E1乙醇脱氢酶或乙醇氧化酶，它依赖于NAD。

E2乙醛脱氢酶，需要NADP作辅酶。

醋杆菌为G-，好氧菌，1mol乙醇转化为1mol醋酸，理论转化率是130％。微生物发酵机制第85页

2热醋酸梭菌生产醋酸热醋酸梭菌在发酵糖类时，由糖到醋酸一步完成，还能够将CO2还原为醋酸。CO2是经过甲酰四氢叶酸（THF）和类咕啉蛋白形成醋酸。但该菌没有氢化酶活性，不能利用氢气。C6H12O6+2H2O2CH3COOH+2CO2+8H++8e

2CO2+8H++8eCH3COOH+2H2O净反应C6H12O63CH3COOH反应在厌氧条件下进行，由己糖或戊糖生成醋酸理论产率都是100％。热醋酸梭菌为产芽孢菌，Ｇ＋，周生鞭毛，耐高温，最适生长温度55～60°C，转化率高，严格厌氧，还能够利用戊糖。但这种方法发酵时需中和剂，所以只适合于醋酸盐。

微生物发酵机制第86页第三节谷氨酸发酵机制

氨基酸发酵工业是利用微生物生长和代谢活动生产各种氨基酸当代工业。氨基酸发酵是经典代谢控制发酵。由发酵所生成产物——氨基酸，都是微生物中间代谢产物，它积累是建立于对微生物正常代谢抑制。也就是说，氨基酸发酵关键是取决于其控制机制是否能够被解除，是否能打破微生物正常代谢调整，人为地控制微生物代谢。微生物发酵机制第87页一.谷氨酸生物合成路径

谷氨酸生物合成路径有EMP路径、HMP路径、TCA循环、乙醛酸循环和CO2固定反应。葡萄糖先生成谷氨酸，依次经鸟氨酸，谷氨酸生物合成精氨酸。谷氨酸生物合成路径如图所表示。微生物发酵机制第88页微生物发酵机制第89页三.谷氨酸发酵代谢控制

谷氨酸发酵代谢控制普通采取以下办法。1．控制发酵环境条件氨基酸发酵受菌种生理特征和环境条件影响，对专性好氧菌来说，环境条件影响更大。谷氨酸发酵必须严格控制菌体生长环境条件，不然就几乎不积累谷氨酸。谷氨酸生产菌因环境条件改变而引发发酵转换，这也就是说氨基酸发酵是人为地控制环境条件而使发酵发生转换一个经典例子。微生物发酵机制第90页

2．控制细胞膜渗透性在发酵过程中，控制使用那些影响细胞膜通透性物质，有利于代谢产物分泌出来，从而防止了末端产物反馈调整，有利于提升发酵产量。以葡萄糖为原料，利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸时，谷氨酸生产菌为α-酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，当谷氨酸合成到达50mg/g（干细胞）时，因为反馈调整作用，谷氨酸合成便终止。假如改变细胞膜通透性，使胞内代谢产物谷氨酸渗透到胞外，有利于提升发酵产量。

微生物发酵机制第91页

所以代谢产物细胞渗透性是氨甚酸发酵必须考虑主要原因。对于谷氨酸发酵来说，生物素是谷氨酸发酵关键物质。当细胞内生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，因而得不到谷氨酸。谷氨酸发酵生产中，谷氨酸生产菌属于生物素缺点型菌种，生物素作为脂肪酸生物合成最初反应关键酶乙酰CoA羧化酶辅酶，参加了脂肪酸合成，进而影响磷脂合成。当磷脂合成降低到正常量二分之一左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。微生物发酵机制第92页

因而能够经过限量控制生物素含量，也就是经过控制生物素亚适量，提升细胞膜渗透性。

在发酵前期，满足细胞生长，合成完整细胞膜；中期生物素耗尽，细胞膜合成不完整，完成长菌型细胞向产酸型细胞转变，细胞膜渗透性增加，使得谷氨酸渗透到细胞外，在细胞内谷氨酸达不到引发反馈调整程度，从而使谷氨酸能够源源不停被优先合成。

微生物发酵机制第93页

影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性物质可分为两大类：一类是生物素、油酸和表面活性剂，其作用是引发细胞膜脂肪酸成份或量改变，尤其是改变油酸含量，从而改变细胞膜通透性；另一类是青霉素，其作用是抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链交联，因为细胞膜失去细胞壁保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。另外，代谢控制还包含控制支路代谢，消除终产物反馈抑制和反馈阻遏等等。微生物发酵机制第94页

第五节抗生素发酵机制

次级代谢产物---(secondarymetabolite)分解代谢：将从环境中吸收各种碳源、氮源等物质降解，为细胞生命活动提供能源和小分子中间体。如TCA、EMP和HMP等。合成代谢：利用分解代谢能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质，及蛋白质、核酸、多糖等多聚物。代谢类型微生物发酵机制第95页一.初级代谢和次级代谢初级代谢：与生物生存相关，包括能量产生和能量消耗代谢类型。产物都是有机体生存必不可少物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。次级代谢：一些微生物为了防止代谢过程中，某种代谢产物积累造成不利作用，而产生一类有利于生存代谢类型，通常是在生长后期产生。产物种类很多，最著名是抗生素，其它还有氨基糖、香豆素、麦角生物碱、吲哚衍生物、核苷、肽、喹啉等。微生物发酵机制第96页

二、微生物合成抗生素与初级代谢关系

1.从代谢方面分析：许多抗生素基本结构是由少数几个初级代谢产物组成，所以次级产物是以初级产物为母体衍生出来，次级代谢路径并不是独立，而是与初级代谢路径有亲密联络。糖代谢中间体，既能够来合成初级代谢产物，又能够来合成次级代谢产物，这种中间体叫分叉中间体，如丙二酰CoＡ。

G乙酰CoＡ丙二酰CoA脂肪酸（初级）

四环素或其它抗生素（次级）微生物发酵机制第97页

初级代谢和次级代谢分叉中间体分叉中间体初级终点产物次级终点产物氨基己二糖赖氨酸青霉素,头孢酶素丙二酰CoＡ脂肪酸四环素族,利福霉素族乙酰CoＡ大环内酯族,多烯族抗生素莽草酸对氨基苯丙氨酸氯霉素,绿脓菌素苯丙氨酸,酪氨酸新生霉素微生物发酵机制第98页由初级代谢产物衍生次级代谢产物路径有七种：葡萄糖碳架掺入路径、莽草酸路径、与核苷相关路径、聚酮糖路径、由氨基酸衍生路径、甲羟戊酸路径、其它复合路径。微生物发酵机制第99页

2.从遗传方面分析：

初级产物和次级产物一样都受到核内DNA调整控制。所不一样是次级代谢产物还受到“与初级代谢产物合成无关遗传物质”控制，即受核内遗传物质（染色体遗传物质）和核外遗传物质（质粒）控制。有一部分代谢产物形成，取决于由质粒信息产生酶所控制代谢路径，这类物质称为质粒产物。因为这类物质形成直接或间接收质粒遗传物质控制,因而产生了质粒遗传观点。当然也有只由染色体DNA控制抗生素。所以，二者在遗传上现有相同部分，又有不一样部分。

微生物发酵机制第100页

三抗生素生产菌主要代谢调整机制

受DNA控制酶合成调整机制，包含酶诱导和酶阻遏（有终点产物和分解产物）；

酶活性调整机制，包含终点产物抑制或活化，利用辅酶酶活调整、酶原活化和潜酶活化；

细胞膜透性调整；

微生物代谢调整机制可从DNA水平研究酶合成调整机制和从酶化学观点研究酶活性调整机制两方面着手，可分为：微生物发酵机制第101页

微生物体内次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢调整。次级代谢产物生物合成调整与初级代谢产物生物合成调整在一些方面是相同，也是调整参加生物合成酶合成（诱导或阻遏）和控制酶活性（激活或抑制）。但次级代谢调整也有其独特一面。以下是影响抗生素合成主要代谢调整机制。微生物发酵机制第102页1初级代谢对次级代谢调整

次级代谢产物合成路径并不是独立存在，而是与初级代谢产物合成路径间存在着紧密联络。次级代谢产物往往都是以初级代谢产物为母体衍生而来，而且催化特殊次级代谢产物合成反应酶也能够从那些初级代谢路径酶演化而来。所以，微生物初级代谢对次级代谢含有调整作用。

微生物发酵机制第103页

当初级代谢和次级代谢含有共同合成路径时，初级代谢终产物过量，往往会抑制次级代谢合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中主要分叉中间体合成。如赖氨酸和青霉素生物合成过程中有共同中间体α-氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制α-氨基己二酸合成，进而影响到青霉素合成。微生物发酵机制第104页2碳代谢物调整

普通情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用。这种抑制作用并不是因为快速利用碳源直接作用结果，而是因为其代谢过程中产生中间产物引发。这种阻遏作用是因为菌体在生长阶段，速效碳源（如葡萄糖和柠檬酸等）分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参加次级代谢酶阻遏，菌体才能转入次级代谢产物合成阶段。微生物发酵机制第105页

20世纪40年代早期就发觉，青霉素发酵过程中，即使葡萄糖被菌体利用最快，但对青霉素合成并不宜。而乳糖利用即使较为迟缓，却能提升青霉素产量。已知有许屡次级代谢产物，如麦角生物碱、头孢菌素C、螺旋霉素、紫色杆菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素、丝裂霉素、杆菌肽、新生霉素、放线菌素和香豆素等生物合成都受到葡萄糖阻遏，因而在这些产物发酵过程中常采取其它碳源。微生物发酵机制第106页3氮代谢物调整

许屡次级代谢产物生物合成一样受到氮分解产物影响。对不一样氮源研究发觉，黄豆饼粉等利用较慢氮源，能够预防和减弱氮代谢物阻遏作用，有利于次级代谢产物合成；而以无机氮或简单有机氮等轻易利用氮作为氮源（铵盐、硝酸盐、一些氨基酸）时，能促进菌体生长，却不利于次级代谢产物合成。比如，易利用铵盐有利于灰色链霉菌快速生长，但对链霉素合成则是最差氮源。微生物发酵机制第107页4磷酸盐调整

磷酸盐不但是菌体生长主要限制性营养成份，还是调整次级代谢产物生物合成主要原因。过量磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调整。

微生物发酵机制第108页

★已发觉过量磷酸盐对四环素类、氨基糖苷类、多烯类和大环内酯类等32种抗生素生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物生物合成只有在适当磷酸盐浓度下才能进行。磷酸盐浓度≥10mmol/L往往对次级代谢产物合成有抑制作用比如，10mmol/L磷酸盐就能完全抑制杀假丝菌素合成。微生物发酵机制第109页★磷酸盐浓度高低还能调整次级代谢产物合成期出现早晚，当磷酸盐靠近耗尽时，才开始进入次级代谢产物合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。如金霉素、万古霉素等发酵都有这些现象。★