基因表达调控常用分子生物学技术专家讲座

蛋白质生物合成（翻译）第十七章基因表达调控常用分子生物学技术第1页第一节

蛋白质生物合成体系基因表达调控常用分子生物学技术第2页基本原料：20种编码氨基酸模板：mRNA适配器：tRNA装配机：核蛋白体主要酶和蛋白质因子：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子等能源物质：ATP、GTP无机离子：Mg2+、K+蛋白质生物合成体系基因表达调控常用分子生物学技术第3页原核生物多顺反子真核生物单顺反子非编码序列核蛋白体结合位点起始密码子终止密码子编码序列PPP5

3

蛋白质PPPmG-5

3

蛋白质AAA…一、mRNA是蛋白质生物合成直接模板基因表达调控常用分子生物学技术第4页遗传密码在mRNA开放阅读框架区，以每3个相邻核苷酸为一组，代表一个氨基酸(或其它信息)，这种三联体形式核苷酸序列称为密码子。起始密码子：AUG终止密码子：UAA、UAG、UGA密码子（codon）起始密码子和终止密码子：基因表达调控常用分子生物学技术第5页遗传密码特点1.方向性2.连续性3.简并性4.通用性5.摆动性基因表达调控常用分子生物学技术第6页二、核糖体是蛋白质生物合成场所基因表达调控常用分子生物学技术第7页三、tRNA是氨基酸运载工具及蛋白质生物合成适配器tRNA作用运载氨基酸：氨基酸各由其特异tRNA携带，一个氨基酸可有几个对应tRNA，氨基酸结合在tRNA3ˊ-CCA位置，结合需要ATP供能；充当“适配器”：每种tRNA反密码子决定了所携带氨基酸能准确地在mRNA上对号入座。基因表达调控常用分子生物学技术第8页四、蛋白质生物合成需要酶类、蛋白质因子等（一）主要酶类氨基酰-tRNA合成酶:催化氨基酸活化；转肽酶：催化核蛋白体P位上肽酰基转移至A位氨基酰-tRNA氨基上，使酰基与氨基结合形成肽键;并受释放因子作用后发生变构，表现出酯酶水解活性，使P位上肽链与tRNA分离；转位酶：催化核蛋白体向mRNA3’-端移动一个密码子距离，使下一个密码子定位于A位。基因表达调控常用分子生物学技术第9页（二）蛋白质因子起始因子（原核IF；真核eIF）延长因子（原核EF；真核eEF）释放因子（原核RF；真核eRF）基因表达调控常用分子生物学技术第10页蛋白质生物合成能源物质为ATP和GTP;参加蛋白质生物合成无机离子有Mg2+、K+

等。（三）能源物质及离子基因表达调控常用分子生物学技术第11页第二节

氨基酸活化基因表达调控常用分子生物学技术第12页氨基酸与特异tRNA结合形成氨基酰-tRNA过程称为氨基酸活化。参加氨基酸活化酶：氨基酰-tRNA合成酶,有高度特异性。反应过程氨基酸+tRNA氨基酰-tRNAATP

AMP＋PPi氨基酰-tRNA合成酶基因表达调控常用分子生物学技术第13页二、肽链合成起始需要特殊氨基酰-tRNA当前已知，尽管都携带着Met，但结合在起始密码子处Met-tRNA，与结合阅读框内部Met密码子Met-tRNA在结构上是有差异，是两种不一样tRNA。在原核生物，起始氨基酰-tRNA是:fMet-tRNAfMet，其中Met被甲酰化，成为N-甲酰甲硫氨酸；而参加肽链延长是甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet真核生物中含有起始功效是：起始氨基酰-tRNAi:Met-tRNAiMet

基因表达调控常用分子生物学技术第14页第三节

肽链生物合成过程基因表达调控常用分子生物学技术第15页起始(initiation)延长(elongation)终止(termination)整个过程可分为：一、原核生物肽链合成过程基因表达调控常用分子生物学技术第16页（一）起始

指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物过程。1.核蛋白体大小亚基分离；2.mRNA在小亚基定位结合；3.起始氨基酰-tRNA结合；4.核蛋白体大亚基结合，形成起始复合物。基因表达调控常用分子生物学技术第17页IF-3IF-1AUG5'3'IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi起始复合物形成过程基因表达调控常用分子生物学技术第18页原核mRNA在小亚基上准确定位和机制：在各种mRNA起始AUG上游约8～13核苷酸部位，存在一段由4～9个核苷酸组成一致序列，富含嘌呤碱基，称为S-D序列，又称核蛋白体结合位点(RBS)。一条多顺反子mRNA序列上每个基因编码序列均拥有各自S-D序列和起始AUG。基因表达调控常用分子生物学技术第19页指在mRNA模板指导下，氨基酸依次进入核蛋白体并聚合成多肽链过程；肽链延长在核蛋白体上连续循环式进行，又称为核蛋白体循环，包含以下三步：1.进位2.成肽3.转位（二）延长每轮循环使多肽链增加一个氨基酸残基。基因表达调控常用分子生物学技术第20页1.进位

又称注册，是指一个氨基酰-tRNA按照mRNA模板指令进入并结合到核蛋白体A位过程。基因表达调控常用分子生物学技术第21页2.成肽

成肽是在转肽酶催化下，核蛋白体P位上起始氨基酰-tRNA甲酰甲硫氨酰基或肽酰-tRNA肽酰基转移到A位并与A位上氨基酰-tRNAα-氨基结合形成肽键过程。基因表达调控常用分子生物学技术第22页成肽反应过程基因表达调控常用分子生物学技术第23页3.转位

转位是在转位酶催化下，核蛋白体向mRNA3´-端移动一个密码子距离，使mRNA序列上下一个密码子进入核蛋白体A位、而占据A位肽酰-tRNA移入P位过程。转位需要延长因子EF和GTP参加。基因表达调控常用分子生物学技术第24页基因表达调控常用分子生物学技术第25页（三）终止终止密码子不被任何氨基酰-tRNA识别，只有释放因子RF能识别终止密码子而进入A位。RF结合可触发核糖体构象改变，将肽基转移酶活性转变为酯酶活性，水解肽链与结合在P位tRNA之间酯键，释出合成肽，促使mRNA、tRNA及RF从核糖体脱离。

指核糖体A位出现mRNA终止密码子后，多肽链合成停顿，肽链从肽酰-tRNA中释放出来，mRNA、核蛋白体大、小亚基等分离过程。基因表达调控常用分子生物学技术第26页RF-3可结合核蛋白体其它部位，有GTP酶活性，能介导RF-1、RF-2与核蛋白体相互作用。释放因子功效：识别终止密码子RF-1特异识别UAA、UAG；RF-2特异识别UAA、UGA。诱导转肽酶转变为酯酶活性催化新生肽链与结合在P位tRNA之间酯键水解，使肽链从核蛋白体上释放。基因表达调控常用分子生物学技术第27页原核肽链合成终止过程基因表达调控常用分子生物学技术第28页

多聚核蛋白体形成能够使蛋白质生物合成以高速度、高效率进行。（四）多聚核蛋白体

不论真核还是原核一条mRNA模板链都可附着10～100个核蛋白体，这些核蛋白体依次结合起始密码子并沿5′→3′方向读码移动，同时进行肽链合成，这种mRNA与多个核蛋白体形成聚合物称为多聚核蛋白体

。基因表达调控常用分子生物学技术第29页多聚核蛋白体基因表达调控常用分子生物学技术第30页第四节

蛋白质翻译后修饰和折叠基因表达调控常用分子生物学技术第31页1.分子伴侣:分子伴侣是细胞内一类可识别肽链非天然构象、促进各功效域和整体蛋白质正确折叠保守蛋白质。(1)热休克蛋白(HSP)(2)伴侣蛋白分子伴侣主要有：一、多肽链折叠为天然构象蛋白质基因表达调控常用分子生物学技术第32页第13章基因表示调控RegulationofGeneExpression基因表达调控常用分子生物学技术第33页第一节

基因表示调控基本概念基因表达调控常用分子生物学技术第34页一、基因表示是指基因转录及翻译过程基因组(genome)来自一个生物体一整套遗传物质。是基因转录及翻译过程，即：生成含有生物学功效产物过程。基因表示(geneexpression)基因表示是受调控。基因表达调控常用分子生物学技术第35页二、基因表示含有时间特异性和空间特异性（一）时间特异性按功效需要，某一特定基因表示严格按特定时间次序发生，称之为基因表示时间特异性。

多细胞生物基因表示时间特异性又称阶段特异性。基因表达调控常用分子生物学技术第36页（二）空间特异性基因表示伴随时间次序所表现出这种分布差异，实际上是由细胞在器官分布决定，所以空间特异性又称细胞或组织特异性。在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不一样组织空间次序出现，称之为基因表示空间特异性。基因表达调控常用分子生物学技术第37页三、基因表示方式及调整存在很大差异按对刺激反应性，基因表示方式分为：基本（或组成性）表示诱导或阻遏表示基因表达调控常用分子生物学技术第38页（一）基本（或组成性）表示一些基因在一个个体几乎全部细胞中连续表示，通常被称为管家基因。不论表示水平高低，管家基因较少受环境原因影响，而是在个体各个生长阶段大多数或几乎全部组织中连续表示，或改变很小。区分于其它基因，这类基因表示被视为组成性基因表示。基因表达调控常用分子生物学技术第39页（二）有些基因表示受到环境改变诱导和阻遏在特定环境信号刺激下，对应基因被激活，基因表示产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表示增强过程，称为诱导。

假如基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表示产物水平降低过程称为阻遏。基因表达调控常用分子生物学技术第40页四、基因表示调控展现多层次和复杂性基因表示多级调控基因激活拷贝数重排甲基化程度转录起始转录后加工mRNA降解蛋白质翻译翻译后加工修饰蛋白质降解等基因表达调控常用分子生物学技术第41页第二节

原核基因表示调控基因表达调控常用分子生物学技术第42页——调整主要步骤在转录起始。一、原核基因转录调整特点（一）σ因子决定RNA聚合酶识别特异性

在转录起始阶段，σ因子识别特异开启序列；不一样σ因子决定特异基因转录激活，决定mRNA、rRNA和tRNA基因转录。基因表达调控常用分子生物学技术第43页（二）操纵子模型普遍性

原核生物绝大多数基因按功效相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位──操纵子（operon）。一个操纵子只含一个开启序列及数个可转录编码基因。通常，这些编码基因可转录出多顺反子mRNA。原核基因协调表示就是经过调控单个开启基因活性来完成。基因表达调控常用分子生物学技术第44页原核生物

蛋白质因子——操纵子(operon)

机制特异DNA序列编码序列

开启序列

操纵序列

其它调整序列(promoter)(operator)基因表达调控常用分子生物学技术第45页是RNA聚合酶结合并开启转录特异DNA序列。1、开启序列RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACATATAAT共有序列图13-1五种E.coli开启序列共有序列基因表达调控常用分子生物学技术第46页（三）原核操纵子受到阻遏蛋白负性调整原核基因调控普遍包括特异阻遏蛋白参加开、关调整机制。当阻遏蛋白与操纵序列结合或解聚时，就会发生特异基因阻遏或去阻遏。基因表达调控常用分子生物学技术第47页二、操纵子调控模式在原核基因转录起始调整中含有普遍性（一）乳糖操纵子(lacoperon)结构

结构基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙酰基转移酶

调控区CAP结合位点开启序列操纵序列调整基因IZYAOPDNAI基因表达调控常用分子生物学技术第48页mRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖存在时（二）乳糖操纵子受阻遏蛋白和CAP双重调整阻遏基因1、阻遏蛋白负性调整基因表达调控常用分子生物学技术第49页mRNA阻遏蛋白有乳糖存在时IDNAZYAOPpol开启转录mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶图13-4lac

操纵子与阻遏蛋白负性调整基因表达调控常用分子生物学技术第50页++++转录无葡萄糖，cAMP浓度高时有葡萄糖，cAMP浓度低时2、CAP正性调整ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAP基因表达调控常用分子生物学技术第51页单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。葡萄糖对lac操纵子阻遏作用称分解代谢阻遏。

基因表达调控常用分子生物学技术第52页惯用分子生物学技术原理及应用第二十章基因表达调控常用分子生物学技术第53页第一节分子杂交与印迹技术基因表达调控常用分子生物学技术第54页核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，假如把不一样DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA单链分子之间有一定碱基配对关系，就能够在不一样分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术原理基因表达调控常用分子生物学技术第55页复性RNADNA基因表达调控常用分子生物学技术第56页（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上墨迹，所以称之为“blotting”，译为印迹技术。基因表达调控常用分子生物学技术第57页用放射性核素、生物素或荧光染料标识其末端或全链已知序列多聚核苷酸链被称为“探针”，探针能够与固定在NC膜上核苷酸结合，判断是否有同源核酸分子存在。（二）探针技术基因表达调控常用分子生物学技术第58页二、印迹技术类别及应用（一）DNA印迹

(SouthernBlotting)（二）RNA印迹(NorthernBlotting)（三）蛋白质印迹

(WesternBlotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体分析。

用于RNA定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。基因表达调控常用分子生物学技术第59页三种印迹技术比较基因表达调控常用分子生物学技术第60页分子杂交试验①②③基因表达调控常用分子生物学技术第61页放射自显影照片基因表达调控常用分子生物学技术第62页第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction(PCR)基因表达调控常用分子生物学技术第63页5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA一、PCR技术工作原理5

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基因表达调控常用分子生物学技术第64页Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA含量能够扩大100万倍以上。基因表达调控常用分子生物学技术第65页模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成份基因表达调控常用分子生物学技术第66页PCR基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C基因表达调控常用分子生物学技术第67页二、PCR技术主要用途（一）目标基因克隆（三）DNA和RNA微量分析（二）基因突变基因表达调控常用分子生物学技术第68页第五节生物芯片技术BiologicalChipTechnique基因表达调控常用分子生物学技术第69页是指将许多特定DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积支持物上，然后与待测荧光标识样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，经过计算机系统对每一位点荧光信号做出检测、比较和分析，从而快速得出定性和定量结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)基因表达调控常用分子生物学技术第70页基因芯片工作流程示意图基因表达调控常用分子生物学技术第71页是将高度密集排列蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕捉样品中靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析一个技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间亲和反应蛋白质芯片(proteinchip)蛋白质芯片作用原理基因表达调控常用分子生物学技术第72页转基因技术第七节基因表达调控常用分子生物学技术第73页转基因技术采取基因转移技术使目标基因整合入动物或植物细胞中，使之发育成个体。

转基因——被导入目标基因转基因动物——目标基因受体动物转基因植物——目标基因受体植物一、转基因技术基因表达调控常用分子生物学技术第74页基因表达调控常用分子生物学技术第75页崔永元柯炳生基因表达调控常用分子生物学技术第76页基因表达调控常用分子生物学技术第77页基因表达调控常用分子生物学技术第78页基因表达调