实验紫外吸收法测定蛋白质含量

关于实验紫外吸收法测定蛋白质含量一、实验目的：学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。第2页,共16页，2024年2月25日，星期天二、实验原理：由于蛋白质中存在着酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比关系，280nm的吸光度故可作为蛋白质定量测定的依据。第3页,共16页，2024年2月25日，星期天第4页,共16页，2024年2月25日，星期天本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛，多用于纯化之蛋白质的微量测定，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。核酸在280nm波长下也有一定吸收能力，可能发生干扰。混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量，再按公式推算蛋白质含量。第5页,共16页，2024年2月25日，星期天三、实验材料、主要仪器和试剂1．试验材料：待测的蛋白质溶液。2．主要仪器：（1）紫外分光光度计（2）试管与试管架（3）移液管3．试剂：浓度为1mg/mL标准酪蛋白溶液第6页,共16页，2024年2月25日，星期天四、操作步骤1．标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。第7页,共16页，2024年2月25日，星期天2．样品测定：

取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水9mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。第8页,共16页，2024年2月25日，星期天第9页,共16页，2024年2月25日，星期天分光光度计的使用第10页,共16页，2024年2月25日，星期天分光光度计的分类分光光度计的分类红外分光光度计:可见光分光光度计:紫外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区

测定波长范围为400~760nm的可见光区测定波长范围为200～400nm的紫外光区第11页,共16页，2024年2月25日，星期天分光光度计的基本结构

无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:

5个基本部件第12页,共16页，2024年2月25日，星期天紫外分光光度计

1．光源：钨灯或卤钨灯——可见光源400～760nm

氢灯或氘灯——紫外光源200～400nm2．单色器：把混合光波分解为单—波长光的装置

3．吸收池（比色皿）：

玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区

石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区4．检测器：将光信号转变为电信号的装置

5．记录装置：讯号处理和显示系统第13页,共16页，2024年2月25日，星期天紫外可见分光光度计使用方法（1）（1）测试准备

①仪器预热30min后方可进行测试。

②将盛有“空白”或“对照”溶液的比色皿处于试样室光路位置；③选择波长

④确定光源

（2）测试过程

①数字显示透光度“100.0”(或吸光度“0.00”)2～3s后，将盛有标准溶液的比色皿移至光路②将盛有样品溶液的比色皿移至光路，记录该样品的数据。待第一个样品数据记录完毕后，将第二个样品置于试样室光路………，若有多个样品，操作以此类推。第14页,共16页，2024年2月25日，星期天分光光度计使用注意事项

（1）预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不可忽略。（2）在波长320nm以下的实验范围一定要选用石英比色皿，绝不可以玻璃比色皿替代。（3）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。先用自来水将用过的比色皿反复冲洗，然后用蒸馏水淋洗，倒立于滤纸片上，待干后再收回比色皿盒中。必要时，还要对比色皿进行更精细的处理，如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。

（4）比