凯氏定氮法测定黄豆的粗蛋白含量

第第页凯氏定氮法测定黄豆的粗蛋白含量凯氏定氮法测定黄豆的粗蛋白含量一、原理利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸汲取。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。2NH2—（CH2）2—COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5H2O（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3二、仪器与试剂1、100mL凯氏烧瓶2、微量凯氏定氮装置3、试剂硫酸铜硫酸钾硫酸2%硼酸溶液混合指示剂:0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%甲基蓝乙醇溶液,临用时按2:1的比例混合.或0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液,临用时按1:5的比例混合。20%NaOH溶液0.01mol/LHCl标准溶液三、测定方法1、样品消化：精准称取粉碎均匀的黄豆粉0.3g左右，当心移入干燥的凯氏烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5gCuSO4、3gK2SO4及10mL浓硫酸，于瓶口倒插入一口径适合的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽出消化过程所产生的烟气。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化，泡沫消失后再加大火力，消化至溶液透亮呈蓝绿色。取下抽气管，连续加热0.5h,冷却至室温。取20mL蒸馏水，缓缓加入烧瓶中，待样品冷至室温，移入100mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，并入容量瓶，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。同时做一空白消化。2、蒸馏与汲取：1按蒸馏装置图安装好装置，将全部的夹子打开。取下样品加入口的磨口塞，从样品加入口加入50mL的蒸馏水，再插回塞好。并给冷凝管接通冷凝水。2往蒸汽发生瓶加入蒸馏水至其体积的三分之二处，加入几粒沸石和4滴甲基橙，再加入3mL浓硫酸，然后置于电炉上加热使水沸腾。3产生蒸汽后，夹上夹子1，让蒸汽经导管进入反应管外套，待废液排放口排出蒸汽后，夹上夹子3，使蒸汽进入反应管，蒸馏洗涤10分钟。打开夹子1，同时夹上夹子2，待反应管内的水全部排出到外套后，打开夹子3，排出废水。立刻从进样口加入蒸馏水约20mL，立刻再夹上夹子3，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。4将全部夹子打开，吸取10mL样液（或空白液）从样品加入口加入到反应管内，插上磨口塞。量取25mL2%硼酸置于250mL锥形瓶内，然后将此汲取液置于冷凝管下端，冷凝管下端应插入到液面以下。再从样品加入口加入约20mL20%NaOH溶液使反应管内的样液有黑色沉淀生成或变成深蓝色，用少量水洗涤加入口，插好磨口塞，并用少量水封口。5夹上夹子1，让蒸汽经导管进入反应管外套，待废液排放口排出蒸汽后，夹上夹子3，使蒸汽进入反应管，蒸馏开始，待汲取液变蓝后计时蒸馏10分钟,将冷凝管下端提离汲取液面，再蒸馏1分钟，用萘氏试剂检查无氨后，停止承接蒸馏液。打开夹子1，同时夹上夹子2，待反应管内的样品废液全部排出到外套后，打开夹子3，排出废液。立刻从进样口加入蒸馏水约20mL，立刻再夹上夹子3，待水排出，反复操作洗涤3次，再作样品平行测定。测定完毕，打开全部夹子，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。3．滴定：用0.01mol/LHCl滴定汲取液至变为红色为尽头，记下消耗的HCl体积。四、计算：蛋白质%=C—HCl标准溶液的浓度mol/LV1